Evaluation of prioritized peptide acquisition for multiplexed single-cell proteomics on an Orbitrap Astral Zoom MS

Význam tématu

Analýza proteomu na úrovni jediné buňky otevírá přímý přístup k buněčné heterogenitě, biologickým stavům a specifickým podpopulacím, které jsou skryté v bulkových měřeních. Hlavními praktickými překážkami jsou ale omezený materiál, nízká citlivost, omezené pokrytí proteomu a potřeba vysokého throughputu pro studie s velkým počtem buněk. Proto jsou metody kombinující izobarické multiplexování (TMTPro) a prioritní řízení akvizice klíčové pro dosažení vysoké datové kompletnosti při zachování citlivosti a průchodnosti.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyhodnotit vysoce průchodný workflow pro multiplexovanou analýzu jednotlivých buněk (TMTPro 35plex) využívající prioritizovanou akvizici peptidů (pSCoPE/pDDA) na Orbitrap Astral Zoom MS. Autoři sledovali citlivost, počet kvantifikovaných proteinů na buňku, míru úspěšnosti identifikací ve srovnání s klasickým DDA a celkový denní throughput (počet buněk za den).

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: Jednotlivé buňky modelu akutní myeloidní leukemie (AML8227), dvě podpopulace (Blast a leukemické kmenové buňky, LSC) se třídily do 384-jamkové destičky, lysovaly a tráveny trypsinem v 1 µL objemu. Každý set obsahoval 31 singlových buněk plus referenční kanály (deuterovaný a non-deuterovaný) pro normalizaci.

Labelování a multiplex: TMTPro 35plex, štěpení a quenchování hydroxylaminem, pooling, okyselení a uložení.

Separace a MS: Vanquish Neo UHPLC v režimu trap-and-elute s 50 cm μPAC Neo Plus kolonkou; akvizice na Thermo Scientific Orbitrap Astral Zoom Mass Spectrometer s 30 SPD (scans per day) metodou. Pro prioritní cílení byly generovány tříúrovňové seznamy priorit z DIA běhu jednoho vzorku zvlášť pro každý FAIMS CV; pro každý seznam vznikl samostatný ddMS2 řetězec. Pro každý peptid bylo definováno retenční časové okno a prahová intenzita (nastavená na 10 %).

Data processing: Thermo Scientific Proteome Discoverer 3.4 s algoritmem CHIMERYS (výchozí nastavení). Použitá databáze: Homo sapiens Swiss-Prot (kanonické sekvence, ~20 528 záznamů).

Hlavní výsledky a diskuse

Počet analyzovaných buněk: 93 singlů ve třech sadách (31 buněk/sada). Výsledky ukazují: vysokou citlivost TMT kvantifikace i pro malé buňky AML8227; průměrně 1 452 kvantifikovaných proteinů na buňku; úspěšnost identifikací výrazně vyšší u prioritní metody (pSCoPE ~48 %) než u konvenčního DDA (~14 %) navzdory tomu, že DDA generovala ~3× více spekter. Celkově pSCoPE přinesla o ~26 % více kvantifikovaných proteinů než DDA.

Analýza PSM abundancí pro jednotlivé kanály ukázala variabilitu mezi buňkami odpovídající rozdílům ve velikosti a fázi buněčného cyklu; přesto byly střední a průměrné hodnoty PSM relativně vysoké, což potvrzuje robustnost TMT signálu v tomto workflow. Autoři rovněž uvádějí, že řízené cílení (priority lists) zvyšuje datovou kompletnost a kapacitu kvantifikace pro biologicky relevantní peptidy.

Přínosy a praktické využití metody

- Výrazné zvýšení throughputu: při použití 30 SPD metody lze podle autorů teoreticky analyzovat více než 1 000 buněk za den, což je zásadní pro studie s vysokým počtem buněčných jednotek.
- Vysoké pokrytí proteomu na jednu buňku (průměrně ~1 452 proteinů na buňku) bez nutnosti carrier kanálu, což minimalizuje potenciální artefakty z nosiče.
- Prioritní (targeted) pSCoPE akvizice zlepšuje míru úspěšnosti identifikací a datovou kompletnost oproti klasické DDA, zejména pro předem definované, biologicky významné peptidy.
- Přístup je vhodný pro porovnání buněčných podpopulací (např. Blast vs. LSC) a pro studie, kde je klíčová kombinace citlivosti a průchodnosti.

Budoucí trendy a možnosti využití

- Optimalizace seznamů cílových peptidů (výběr nejlepších peptideů na protein, filtrování podle biologické relevance) a upřesnění retenčních časových oken může zvýšit počet triggerovaných cílových peptidů a tím i počet kvantifikovaných proteinů.
- Snížení nebo odstranění dvou referenčních kanálů (např. použitím pouze deuterovaných labelů pro jednu podskupinu a non-deuterovaných pro druhou) by umožnilo zvýšit počet analyzovaných singlů na vzorek (až 35 buněk na vzorek), což dále zlepší statistiku a throughput.
- Kombinace prioritní akvizice s pokročilými algoritmy pro dekonvoluci chimérických spekter a s lepšími predikcemi RT by mohla dále zlepšit citlivost a kvalitu kvantifikace v single-cell aplikacích.
- Rozšíření workflow na jiné typy citlivých buněčných modelů a klinických vzorků může pomoci implementovat single-cell proteomiku do translací a diagnostiky.

Závěr

Studie demonstruje, že kombinace TMTPro 35plex multiplexování a prioritní (pSCoPE) akvizice na Orbitrap Astral Zoom MS poskytuje vysokou citlivost, solidní proteomické pokrytí na úrovni jednotlivých buněk a velmi vysoký potenciální throughput (>1 000 buněk/den při 30 SPD). Metoda překonává konvenční DDA v míře identifikací a v počtu kvantifikovaných proteinů, přičemž není nutné použití carrier kanálu. Dálší optimalizace cílových seznamů a RT oken slibuje další zlepšení výkonu a ještě vyšší propustnost pro velké single-cell studie.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Orbitrap Astral Zoom Mass Spectrometer
• Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC System
• Thermo Scientific μPAC Neo Plus HPLC Column (50 cm, trap-and-elute režim)
• FAIMS (pro oddělené CV při generování priority lists)
• TMTPro 35plex chemikálie pro izobarické labelování
• Thermo Scientific Proteome Discoverer 3.4 s CHIMERYS algoritmem pro zpracování dat
• FASTA: Homo sapiens Swiss‑Prot (kanonické sekvence, ~20 528 záznamů)

Reference

1. Budnik et al., 2018
2. Huffman et al., 2023