Characterizing 32-plex TMTpro reagents for high-throughput quantitative proteomics on Orbitrap platforms

Význam tématu

Multiplexní kvantitativní proteomika založená na isobarických TMTpro značkách umožňuje současné měření stovek vzorků v jedné LC–MS/MS analýze. Rozšíření kapacity multiplexu na 32 či 35 kanálů zvyšuje propustnost, snižuje spotřebu vzorku a eliminuje variabilitu mezi běhy analýzy.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo charakterizovat novou variantu TMTpro reagencií rozšířenou o deuterované izotopology, hodnotit jejich schopnost rozlišení v Orbitrap analyzátoru a porovnat kvantitativní výkon 32-plex multiplexu s existujícími 16- a 18-plex formáty.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: HeLa S3 celulární digest, značení pomocí Thermo Scientific EasyPep protokolu.
Chromatografie:

• UHPLC Vanquish Neo s 50 cm C18 EASY-Spray kolonkou
• Gradient 2–32 % ACN/0,1 % FA, 120 min, 300 nL/min

Detekce:

• Orbitrap Eclipse Tribrid MS
• FT-MS survey scan při RP 120 000 (200 m/z)
• HCD FT-MS2 při RP ≥ 75 000 nebo TurboTMT 45 000
• Volitelně RTS SPS-MS3 při TurboTMT 30 000

Data processing:

• Proteome Discoverer 3.2, algoritmus SEQUEST HT
• UniProt lidská databáze, statická karbamidomethylace, dynamická oxidace
• FDR 1 % (Percolator), integrace reporter iontů ±11 ppm

Hlavní výsledky a diskuse

1. Izotopové rozlišení

• Deuterované reporter ionty Δm 3 mDa jsou částečně rozlišitelné při RP 75 000, plně při ≥ 90 000.
• Při RP 45 000 TurboTMT a 75 000 eFT nastává nejlepší kompromis mezi počtem PSMs, rychlostí a přesností kvantifikace.

2. Retenční posun

• Deuterované kanály vykazují posun retenční doby o 0,5–1 s ve srovnání s ne-deuterovanými, ko-eluce uvnitř svých pod-plexů je však velmi konzistentní.

3. Kvantitativní výkon

• 32-plex poskytuje obdobný počet kvantifikovaných proteinů a peptidů jako 16- či 18-plex při vhodném nastavení RP.
• Offline vysokopH frakcionace zvýšila počet kvantifikovaných proteinů z ~3 500 na ~6 450.
• SPS-MS3 export z 32-plexu zvýšil počet proteinů o 15 % a peptidů o 39 % oproti dvěma běhům s 18-plex.
• Koeficient variační (CV) se pohybuje kolem 6–8 % pro 32-plex a 16-plex a ~17 % při referencování napříč pod-plexy bez normalizace.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost simultánního měření až 32–35 vzorků v jednom běhu s minimalizací chyb mezi analýzami.
• Vhodné pro rozsáhlé klinické kohorty, farmakologické studie a komparativní proteomiku s vysokou propustností.
• Integrace do standardních pracovních postupů LC–MS/MS bez nutnosti drahých modifikací či složité syntézy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozšíření multiplexu a zlepšení čidel Orbitrap k dosažení vyššího rozlišení a rychlosti.
• Vývoj nových izotopových konfigurací pro překrytá okna detekce a hlubší proteomickou pokrytí.
• Využití strojového učení a real-time rozhodování pro optimalizaci DDA a kvantifikace.
• Aplicace v personalizované medicíně, časově rozlišené proteomice a interakcích protein–protein.

Závěr

Deuterované TMTpro 32-plex reagencie představují účinné rozšíření multiplexní proteomiky na Orbitrap platformách. Nabízí vysokou přesnost i propustnost, srovnatelnou s dosavadními 16- a 18-plex řešeními, a otevírají nové možnosti pro rozsáhlé kvantitativní studie.

Reference

• Frost D. et al. Characterizing 32-plex TMTpro reagents for high-throughput quantitative proteomics on Orbitrap platforms. Thermo Fisher Scientific, Application Note PO368-2025-EN.
• Thermo Fisher Scientific Proteome Discoverer 3.2 Software
• University of Washington. SEQUEST® HT.