Structural characterization of ligand-bound RNA hairpins on an Orbitrap Tribrid Mass Spectrometer

Význam tématu

Oligonukleotidy a jejich vyšší řádová struktura hrají klíčovou roli v současném výzkumu i ve farmaceutickém vývoji; určují interakce s ligandy, stability a biologickou aktivitu. Metody schopné mapovat vazebná místa ligandů a hodnotit konformační změny přímo na molekule RNA jsou proto zásadní pro design terapeutik, validaci targetů a pochopení mechanismů vazby malých molekul nebo barviv. Studie demonstruje schopnost top‑down MSⁿ natívními přístupy detekovat a lokalizovat vazebná místa na hairpin RNA a rozlišit různé mechanismy interakce ligandů.

Cíle a přehled studie

• Vyvinout a ověřit top‑down MSⁿ konformaci‑citlivé fragmentační přístupy pro studium strukturálních efektů vázání ligandů na hairpin RNA.
• Porovnat aktivace lqCID a kombinaci UV‑indukované fotoodtržení elektronů (a‑EPD) následované lqCID pro schopnost generovat informační fragmenty.
• Mapovat vazebná místa dvou RNA‑barviv (SYTO RNASelect Red a Quant‑iT RiboGreen) na 59nt hairpin RNA a vyhodnotit jejich vliv na konformaci molekuly.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorek: syntetická hairpin RNA 59 nt (23 bp hlavní stopa) s několika interními smyčkami; příprava v 50 mM amonném acetátu, annealing při 95 °C s MgCl₂ pro podporu správného skládání.
• Ligandy: SYTO RNASelect Red a Quant‑iT RiboGreen (přidávány v poměru RNA:barvivo od 1:1 do 1:20, inkubace 30 min).
• Ionizace: nanoESI v natívním režimu, pozitivní i negativní polarita.
• MS přístroje: Thermo Scientific Q Exactive UHMR (MS1 natívní přímá infuze, 200k rozlišení) a Orbitrap Tribrid Apex (top‑down MSⁿ, vybaven 213 nm UV laserem pro fotoodtržení elektronů).
• Fragmentační protokoly: low‑q CID (lqCID) samostatně a v kombinaci s aktivovaným elektronovým fotoodtržením (a‑EPD → UV 213 nm následně lqCID) provedené v lineárním ion‑trapu; izolace s quadrupolem v rozsahu 2–5 Th; MS/MS v Orbitrapu při 240k rozlišení, průměrování 50–150 transients.
• Analýza dat: BioPharma Finder pro MS1 dekonvoluci; OligoFinder pro mapování fragmentů a lokalizaci vazeb (10 ppm toleranční limit).

Hlavní výsledky a diskuse

• ApoRNA: natívní MS1 ukázala přítomnost kovových aduktů (1–8 Na⁺, K⁺ nebo Mg²⁺). V pozitivním režimu byl detekovatelný i adukt‑volný apoRNA a potvrzená molekulová hmotnost. Pro top‑down byla primárně zvolena iontová stopa ve stavu −8 (m/z ~2342).
• Fragmentace: lqCID vedla obecně k vyšší míře fragmentace než kombinovaná a‑EPD–lqCID při použitých nízkých nábojových stavech a relativně velkém 59 nt RNA; u kombinace a‑EPD–lqCID se však generovaly komplementární d a w ionty, které přispěly k lokalizaci vazeb.
• RiboGreen: při poměru 1:20 bylo pozorováno až 11 molekul barviva v komplexu (detekováno pouze v pozitivním režimu). Top‑down analýza nevedla k identifikovatelným sekvenčním fragmentům, což indikuje výrazné zvýšení strukturální stability RNA po vazbě, konzistentní s interkalací mezi báze v A‑form hlavní stopy (mezi bází ≈ 11 bp/otáčka).
• RNASelect Red: vykazoval odlišný vzorec interakce — vazba byla lokalizovaná do vrcholové smyčky hairpinu a ne do interních smyček nebo 5' bulgu. Lokalizace byla dosažena: U31 pro 1:1 komplex a G28 plus U31 pro 2:1 komplex. a‑EPD–lqCID poskytl komplementární fragmenty umožňující přesnou lokalizaci vazby, zatímco samotné lqCID často nepostačovalo k lokalizaci.

Přínosy a praktické využití metody

• Top‑down natívní MSⁿ na Orbitrap Tribrid umožňuje mapovat vazebná místa ligandů na RNA bez nutnosti chemického značení či štěpení vzorku, což šetří materiál a zachovává natívní konformaci komplexu.
• Metodika rozliší různé režimy interakce ligand–RNA (interkalace versus specifická smyčková vazba) a hodnotí vliv na konformační stabilitu RNA — užitečné při screeningu ligandů, hodnocení farmakoforů a designu oligonukleotidových léčiv.
• Možnost kombinovat fotoodtržení elektronů s chromatografickými/nechromatografickými přístupy a cílenou selekcí nábojových stavů zvyšuje informační obsah fragmentačních spekter.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření kombinací aktivací (např. UV‑EPD s elektronovou detachem a dalšími radikálovými způsoby) a optimalizace nábojových stavů pro lepší sekvenční pokrytí větších oligonukleotidů.
• Integrace ion‑mobility separace pro rozlišení konformačních izomerů a kvantifikaci populace vázaných vs. nevázaných forem.
• Využití vyššího paralelismu a automatizace pro screening knihoven ligandů v natívním MS, spojující rychlý přenos informací s lokalizací vazebných míst.
• Vylepšení softwaru pro mapování fragmentů oligonukleotidů (vyšší přesnost, modely detekce aduktů, lepší vizualizace výsledků) a integrace s predikcí 3D struktury RNA pro korelaci dat MS s modely konformací.
• Možné kombinace s crosslinkingovými metodami, NMR nebo cryo‑EM pro víceúrovňové potvrzení vazebných míst a konformačních změn.

Závěr

Top‑down natívní MSⁿ provedená na Orbitrap Tribrid a Q Exactive UHMR prokázala schopnost rozlišit různé režimy vazby barviv k hairpin RNA a lokalizovat specifická vazebná místa. lqCID poskytuje robustní fragmentaci, zatímco kombinace a‑EPD–lqCID generuje komplementární ionty užitečné pro lokalizaci. Metoda je perspektivní pro strukturální charakterizaci oligonukleotidů a má přímé uplatnění v oblasti vývoje RNA‑cílených ligandů a oligonukleotidových terapií.

Reference

1. Hinkle JD, McGee W, Salem JP, Mullen C, Kronewitter SR, Yip P, Syka JEP, Stephenson JL Jr. Optimized Fragmentation of Oligonucleotides Suppresses Undesired Fragmentation Products and Enables Confident Sequence Assignment. ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics; 2023; Houston, TX.
2. Purzycka KJ, Popenda M, Szachniuk M, et al. Automated 3D RNA structure prediction using the RNAComposer method for riboswitches. Methods Enzymol. 2015;553:3-34.