Addressing the challenge of rapid drug metabolite identification using Cyclic Ion Mobility Mass Spectrometry

Význam tématu

Rychlé a spolehlivé určení metabolitů léků je klíčové v raných fázích vývoje léčiv (ADME), kde rozhoduje o dalším výběru kandidátů. S narůstající potřebou throughputu se zkracují LC gradienty, což zvyšuje riziko koeluce izomerů a izobarických konjugátů (např. glukuronidů). Kombinace rychlé UHPLC separace a cyklické iontové mobility (cyclic IMS) spojené s vysokorozlišovacím MS nabízí cestu, jak zachovat identifikaci a kvantifikaci i při zkrácených analytických časech.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat, že propojení 10minutové reverzní UHPLC s cyclic IMS–QToF (HDMSE) umožní:

• rychlé a přesné vyhledání a sledování metabolitů v hepatocytárních inkubacích,
• rozlišení izomerických glukuronidů použitím prodloužené dráhy iontové mobility (multipass IMS),
• zvýšení citlivosti pomocí Wideband Enhancement (WBE),
• integraci výsledků do workflow s nástroji typu waters_connect a MassMetaSite pro strukturální přiřazení a časový monitoring.

Použitá instrumentace

Analytika byla prováděna na kombinačním systému zahrnujícím:

• UHPLC (10 min reverzní gradient)
• Cyclic IMS–QToF (HDMSE) s možností multipass IMS (dráha 1–5 m)
• Elektrospray ionizace v pozitivním režimu (+ESI)
• Funkce Wideband Enhancement (WBE) pro zvýšení citlivosti
• Softwarové nástroje: MassLynx pro akvizici, waters_connect (včetně CCS on Demand) pro zpracování a časové profily, MassMetaSite pro predikci a přiřazení metabolitů.

Použitá metodika

Jako modelové sloučeniny byly zvoleny diclofenac a raloxifene (obě 1 µM) inkubované samostatně v lidských hepatocytech (1×10^6 buněk/mL). Odběry vzorků probíhaly v časovém intervalu 0–60 min, vzorky byly quenchovány metanolem, vortexovány, centrifugovány a analyzovány 10minutovým UHPLC–Cyclic IMS–MS (HDMSE). Iontová dráha byla variována (1–5 m) za účelem posouzení separace izomerů. Data se pořizovala v MassLynx a zpracovávala v waters_connect a MassMetaSite; přiřazení se ověřovalo pomocí predikovaných CCS hodnot (CCS on Demand) s akceptační tolerancí ≤5 % odchylky. Standardy glukuronidů byly využity pro vyhodnocení linearity, citlivosti (WBE) a pro validaci multi-pass IMS separace.

Hlavní výsledky a diskuse

Hlavní pozorování ze studie:

• Identifikace metabolitů: Rychlý UHPLC–cyclic IMS–MS identifikoval potenciální glukuronidové metabolity diclofenacu a raloxifenu s velmi nízkou hmotnostní chybou (<2 ppm) a podpůrnými fragmenty i CCS hodnotami. U raloxifenu byly nalezeny dva putativní glukuronidy v retenčních časech 3.55 a 3.82 min (60 min časový bod). Diclofenac glukuronid byl vyznačen u ~4.96 min.
• Časový průběh metabolizace: waters_connect umožnil generovat časové profily a sledovat kinetiku tvorby metabolitů v průběhu inkubace (příklad raloxifenu).
• Separace izomerů pomocí multipass IMS: Prodlužení iontové dráhy (multipass IMS, až 5 m) vedlo k rozlišení izomerických glukuronidů raloxifenu vznikajících při konjugaci na rozdílných pozicích (4′ a 6′). To umožňuje zkrátit LC gradienty, protože některé izomery lze rozlišit v driftovém čase místo v retenčním čase.
• Citlivost a linearita: Použití WBE významně zvýšilo signál; při kalibraci 0.01–25 ng/mL byla špičková šumová poměr (peak‑to‑peak S/N) pro 0.01 ng/mL 24.5 s WBE versus 13.3 bez WBE. U diclofenacu bylo pozorováno přibližně 10× vyšší odpovědi s aktivovaným WBE při 0.1 ng/mL. Kalibrační křivky vykazovaly R2 hodnoty blízké 0.99.
• Kompatibilita workflow: Výstupy byly plně kompatibilní s MassMetaSite pro strukturální přiřazení a dále zpracovatelné v externích nástrojích.

Diskuse: Kombinace krátkého LC běhu a prodloužené IMS dráhy představuje praktický kompromis mezi throughputem a kvalitní strukturální informací. Predikované CCS hodnoty se ukázaly jako cenné ortogonální kritérium při potvrzování struktur metabolitů, zejména tam, kde chromatografie neodliší izomery.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické přínosy řešení zahrnují:

• Rychlejší screening metabolitů v raných ADME studiích bez zásadního kompromisu na jistotě identifikace.
• Možnost zkrácení LC metod díky využití IMS pro separaci izomerů, což zvyšuje throughput laboratorních provozů.
• Výrazné zvýšení citlivosti pomocí WBE, které zlepšuje LOD/LOQ a umožňuje kvantifikaci při velmi nízkých koncentracích.
• Integrace s nástroji pro predikci a časovou analýzu usnadňuje rozhodování při výběru kandidátů v raných fázích vývoje.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje a aplikace zahrnují:

• Širší nasazení multipass IMS v rutinních ADME workflow pro spolehlivou separaci izomerů bez nutnosti dlouhých LC gradientů.
• Pokročilejší databáze a in silico predikce CCS pro rychlejší potvrzování struktur nových metabolitů.
• Další optimalizace WBE a kontinuální zlepšení instrumentální citlivosti pro sledování trace metabolitů a reaktivních meziproduktů.
• Integrace IMS‑CCS metrik jako standardního kritéria ve validacích metod a regulačních souborech dat.

Závěr

Studie demonstruje, že kombinace krátké UHPLC metody s cyclic IMS–QToF a aktivací WBE poskytuje vyvážené řešení pro rychlou, citlivou a věrohodnou identifikaci a kvantifikaci metabolitů v hepatocytárních inkubacích. Multipass IMS umožňuje rozlišit izomerické glukuronidy, čímž umožní zkrácení chromatografických běhů bez ztráty informační hodnoty. Predikované CCS hodnoty slouží jako užitečné ortogonální kritérium pro zvýšení důvěry v identifikace.

Reference

1. Munjoma N., Marcotte A., Plumb R., Marsden-Edwards E. Addressing the challenge of rapid drug metabolite identification using Cyclic Ion Mobility Mass Spectrometry. Waters Corporation, 2026. Poster (720009456EN).