HIGH THROUGHPUT MULTI-OMIC ANALYSES AT THE SINGLE CELL LEVEL USING ANALYTICAL SCALE CHROMATOGRAPHY WITH A MULTI-REFLECTING HIGH RESOLUTION MASS SPECTROMETER

Význam tématu

Single cell lipidomika a metabolomika odkrývá heterogenitu na úrovni jednotlivých buněk, která bývá skrytá v hromadných (bulk) analýzách. Schopnost detekovat a kvantifikovat lipidy a polarní metabolity z jediné buňky má zásadní význam pro biomedicínský výzkum, onkologii, farmakokinetiku a studium buněčných odpovědí na stres nebo léčiva. Vyšší propustnost, spolehlivost a senzitivita analytických workflow zrychlí objevování biologických markerů a usnadní přenos metody do rutinních laboratoří.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit vysoko-propustné LC–MS workflow založené na konvenční analytické chromatografii (2.1 mm kolona) a vysoce rozlišujícím multi-reflektujícím TOF (Xevo MRT P10) pro simultánní multi-omic analýzu jednotlivých buněk. Modelovými biologickými systémy byly humánní nádorové buněčné linie HT-29 a Caco-2. Studie se zaměřila na dosažení vysoké citlivosti, širokého dynamického rozsahu, minimálního pozadí/artefaktů a efektivního zpracování dat pro identifikaci lipidů a polarních metabolitů z jednoho buněčného extraktu.

Použitá metodika a instrumentace

• Kultivace buněk: HT-29 a Caco-2 kultivované v DMEM při 37 °C s 5 % CO2 po dobu až 21 dnů; před odběrem se buňky separovaly TryLE a upravily na koncentraci ~15 000 buněk/mL.
• Izolace jedné buňky: isoPick platforma (IotaSciences) pro selektivní vychytání jednotlivých buněk do LC–MS vialů.
• Extrakce: použití isopropanolu (IPA) pro lipidní extrakci jednotlivých buněk.
• Chromatografie: analytická škála 2.1 mm CSH Phenyl-Hexyl kolona s MaxPeak technologií; aktivní gradient 6,0 min (injekce–injekce ~6 min), konfigurace umožňuje analýzu lipidů i polarních metabolit bez nutnosti měnit mobilní fázi.
• Hmotnostní spektrometrie: Xevo MRT P10 (multi-reflecting high resolution TOF) s režimy DDA a DIA; data exportována do formátu mzML v reálném čase.
• Informatika a zpracování dat: LipoStar2 pro peak picking, normalizaci a pravidly řízené přiřazení lipidů; MS-DIAL pro dekonvoluci DIA dat a identifikaci metabolitů využívající .msp knihovnu autentických standardů; databáze LipidMaps a interní databáze pro doplnění identifikací.

Hlavní výsledky a diskuse

• Senzitivita a dynamický rozsah: Xevo MRT P10 umožnil více než 5 řádů in-sample dynamického rozsahu pro některé single-cell extrakty, obecně >4–5 řádů, což podpořilo detekci širokého spektra složek v jedné buňce.
• Počet identifikací: Z jednoho buněčného extraktu bylo kurátorsky ověřeno více než 400 lipidních identifikací a více než 300 metabolitů.
• Hlavní lipidové třídy: nejhojněji zastoupené byly triglyceridy (TAG) a fosfolipidy; dále byly detekovány ceramidy a další podtřídy. Mezi HT-29 a Caco-2 se objevily jasné rozdíly v relativní expresi vybraných lipidů.
• Kvalita dat a robustnost: chromatogramy blanků před i po analýze prokázaly absenci přenosu (carryover). MaxPeak povlakování komponent minimalizovalo nespecifické vazby (významné zejména pro fosfátové a karboxylátové lipidy jako fosfatidová kyselina) a zvýšilo návratnost a S/N.
• Statistické zpracování: hierarchické shlukování (Ward, eukleidovská vzdálenost) a volcano ploty identifikovaly diferencující znaky mezi buňkami; top 100 diferenciálních features byla podrobena dalšímu databázovému vyhledávání a curation.
• Workflow pro multi-OMIC: použití fenyl-hexyl chemie umožnilo provádět lipidomiku a polar metabolomiku s jednou sadou mobilních fází, čímž se zjednodušil pracovní postup a zvýšila průchodnost analýz.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká propustnost: analytická kolona 2.1 mm a krátký 6 min gradient umožňují vysoký počet analýz za jednotku času, vhodné pro screening a studie s mnoha single-cell replikáty.
• Široké pokrytí: simultánní detekce stovek lipidů a metabolitů z jedné buňky rozšiřuje možnost objevování buněčné heterogenity a biomarkerů.
• Snížené artefakty: eliminace IPA z mobilní fáze a MaxPeak povlak snižují pozadí a ztráty analytů, což zlepšuje kvalitu identifikací.
• Přenositelnost: použití standardní analytické chromatografie usnadňuje adopci v laboratořích, které nemají zkušenost s kapilární LC.
• Flexibilita informatiky: export dat do mzML okamžitě během akvizice podporuje integraci s různými softwarovými nástroji a umožňuje pravidly řízené curation pro vysokou důvěryhodnost identifikací.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikací do klinických a translational studií pro identifikaci buněčně specifických lipidových a metabolitových markerů, např. v onkologii nebo farmakologii.
• Integrace s dalšími single-cell technikami (transkriptomika, proteomika) pro skutečně multi-omické profily jednotlivých buněk.
• Optimalizace přípravy vzorku a automatizace pickování buněk za účelem zvýšení reproducibility a snížení variability mezi experimenty.
• Vylepšení knihoven MS/MS a pravidel pro curation, které rozšíří jistotu při identifikacích méně obvyklých lipidových struktur nebo izomerů.
• Možné použití vyššího rozlišení a kvantitativních strategií (např. interní standardy) pro absolutní kvantifikaci vybraných molekul na úrovni jednotlivých buněk.

Závěr

Předložené workflow demonstruje, že kombinace konvenční analytické LC (2.1 mm, CSH Phenyl-Hexyl) a vysoce citlivého multi-reflektujícího TOF (Xevo MRT P10) umožňuje vysokopropustnou, robustní a vysoko-kvalitní multi-omic analýzu jednotlivých buněk. Metoda dosahuje stovek identifikací lipidů a metabolitů z jednoho buněčného extraktu, s dynamickým rozsahem přesahujícím 5 řádů a minimálním pozadím či carryover. Toto řešení je prakticky přenositelné do laboratorního provozu a nabízí platformu pro detailní studium buněčné heterogenity a objev biomarkerů.

Použitá instrumentace

• Xevo MRT P10 (multi-reflecting high resolution TOF)
• CSH Phenyl-Hexyl kolona s MaxPeak technologií (2.1 mm geometrie)
• isoPick platforma (IotaSciences) pro single-cell pickování
• Softwarové nástroje: LipoStar2, MS-DIAL; databáze: LipidMaps a interní databáze; formát exportu: mzML

Reference

• SWATH-MS/MS and DIA-MS: MS-DIAL data independent MS/MS deconvolution for comprehensive metabolome analysis. Nature Methods, 2015, 12, 523-526.
• Development of a single mobile phase for LC-IM-MS-based discovery lipidomics and metabolic phenotyping: Application to methapyrilene hepatoxicity in the rat. J Chromatogr A., 2024, 1714:464552.