High-throughput Single Cell Lipidomics LCMS/ MS Workflow Using the Xevo™ MRT P10 Mass Spectrometer

Význam tématu

Single-cell lipidomics otevírá možnost charakterizovat heterogenitu lipidových profilů na úrovni jednotlivých buněk, což je klíčové pro pochopení biologických procesů, patofyziologie a pro translaci do medicíny. Metody založené na LC‑MS tradičně pracují s odběry z homogenizovaných vzorků, které maskují subpopulační odchylky. Popsaný pracovní postup demonstruje, že je možné dosáhnout citlivosti potřebné pro analýzu jednotlivých buněk při současném zachování vysoké propustnosti a robustnosti, což usnadní širší adopci v laboratořích bez nutnosti nanoflow infrastruktury.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo vyvinout a ověřit vysoce propustný analytický‑průtokový LC‑MS/DIA postup pro single‑cell lipidomiku, který je citlivý, reprodukovatelný a použitelný v běžných cell culture laboratořích. Studie prezentuje kompletní workflow včetně izolace buněk, jednorázové extrakce v injekčních lahvičkách, 6,5min chromatografie, akvizice MSE na Xevo MRT P10 a následného bioinformatického zpracování (waters_connect → Lipostar → LMSD).

Použitá metodika a instrumentace

Popis experimentu a klíčové parametry:

• Biologický materiál: Caco‑2 a HT29‑MTX kultury; buňky rozpuštěny, rozředěny (~15 000 cells/mL) a izolovány jednímí buňkami pomocí isoPick platformy.
• Odběr a příprava: jednotlivé buňky se sbíraly přímo do předmražených skleněných Qsert vial, přidáno 10 µL ledově studeného isopropanolu obsahujícího EquiSPLASH (16 ng/mL) – jednorázová extrakce v lahvičce, skladování −80 °C.
• LC: ACQUITY Premier UPLC, kolona ACQUITY Premier CSH Phenyl‑Hexyl 2.1×50 mm, 1.7 µm; teplota kolony 70 °C; průtok 0.7 mL/min; injekce 10 µL; mobilní fáze A voda + 0.1% FA +1 mM NH4F (resp. formátovaný) a B 95% acetonitril + 0.1% FA +1 mM NH4F; metoda injection→injection 6.5 min.
• MS: Xevo MRT P10; ionizace v pozitivním módu; capillary 2.8 kV; sampling cone 40 V; source temp 120 °C; desolvation 500 °C; cone gas 50 L/hr; desolvation flow 750 L/hr; akvizice MSE continuum 50–1200 Da; scan speed 10 Hz; CE ramp 20–40 eV.
• Zpracování dat: konverze na mzML pomocí waters_connect; zpracování v Lipostar (prahování, blank‑correction, normalizace vůči EquiSPLASH); vyhledávání proti LIPID MAPS® Structure Database (MS tolerance 2 ppm); vizualizace interních standardů v Skyline po vytvoření transition listu v LipidCreator.

Hlavní výsledky a diskuse

K nejvýznamnějším zjištěním patří:

• Citlivost a počet identifikací: více než 180 lipidů bylo reprodukovatelně identifikováno ze single‑cell vzorků; přes 300 tentative anotací celkem; z toho ~80 lipidů bylo anotováno s vysokou jistotou (mass accuracy <1 ppm).
• Rozložení lipidových tříd: nejvíce identifikací tvořily ceramidy, diglyceridy a triglyceridy; významnou skupinou byly také fosfolipidy (PC, PI apod.).
• Chromatografie a propustnost: analytický‑průtoková metoda (0.7 mL/min, acetonitril místo izopropanolu) umožnila stabilní, nízkotlakou separaci s krátkým cyklem 6.5 min, vhodnou pro vysokou propustnost a potenciální multi‑omics aplikace.
• Konfidenciální identifikace: kombinace vysokého rozlišení a přesnosti hmotnosti Xevo MRT P10 (průměrně <1 ppm na interních standardech) spolu s diagnostickými fragmenty (např. PC headgroup m/z 184.074 nebo TG fragmenty) umožnila spolehlivou identifikaci a zvýšila důvěru při porovnání s LMSD.
• Kontaminace a manipulace: klíčová byla kontrola kontaminantů — použití skleněných vial, okamžité chlazení (−20 °C modul, následně −80 °C) a jednorázová extrakce v lahvičce snížily pozadí a ztráty analytu.

Poznámka k obrázkům a tabulkám: Autoři ilustrovali workflow (isoPick → sběr → jednorázová extrakce), distribuční grafy retencí interních standardů a reprezentativní XIC/MS2 spektra potvrzující fragmentaci TG a PC. Tabulka se seznamem detekovaných EquiSPLASH standardů demonstruje detekci většiny přidaných standardů (až dva adukty), s výjimkou některých tříd (PS, CE, MG).

Přínosy a praktické využití metody

Praktické výhody a aplikace:

• Vysoká propustnost: 6.5min běh umožňuje vysokou kapacitu analýzy pro studium velkých buněčných populací nebo screeningových experimentů.
• Dostupnost: použití analytického průtoku místo nanoflowu snižuje požadavky na údržbu, eliminuje vysoké tlakové režimy a umožňuje širší adopci v laboratořích s konvenční LC‑MS výbavou.
• Zlepšená jistota identifikací: mass accuracy <1 ppm a diagnostické fragmenty zvyšují spolehlivost anotací při vyhledávání v databázích.
• Jednoduchost přípravy: jednorázová in‑vial extrakce redukuje ztráty vzorku a možné kontaminace, což je zásadní při práci s jedinými buňkami.
• Flexibilita: použití phenyl‑hexyl CSH kolony umožňuje separaci izomerů založenou na π‑π interakcích a lepší kompatibilitu s acetonitrilem pro multi‑omics analýzy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možné směry dalšího rozvoje a aplikací:

1. Rozšíření metodiky do negativního ionizačního módu a optimalizace pro jiné lipidové třídy citlivé na polarity.
2. Integrace s iontovou mobilitou (IMS) pro lepší rozlišení izomerů a konformačních variant lipidů.
3. Automatizace manipulace s jednotlivými buňkami a robotizované skladování pro vyšší throughput a reprodukovatelnost.
4. Pokročilé datové přístupy: použití strojového učení pro anotace MS/MS spekter a konsolidaci výsledků mezi laboratořemi; vytváření standardizovaných datových balíčků pro sdílení.
5. Multiomics: spojení single‑cell lipidomiky s proteomikou/transkriptomikou pro komplexní mapování buněčné heterogenity.
6. Standardizace a kontrola kvality: rozvoj referenčních materiálů a validovaných protokolů pro single‑cell lipidomiku a minimalizaci laboratorních artefaktů (mikroplasty, kontaminace skel apod.).

Závěr

Studie ukazuje, že kombinace analytického průtoku s krátkou 6.5min chromatografií a moderním vysokorychlostním Q‑ToF (Xevo MRT P10) umožňuje spolehlivou a vysoce propustnou single‑cell lipidomiku bez nutnosti nanoflow instrumentace. Postup nabízí robustní řešení vhodné pro širší adopci v aplikacích vyžadujících vysokou kapacitu analýzy a dobrou kvalitu anotací lipidů.

Reference

1. Satomi Y., Hirayama M., Kobayashi H. One‑step lipid extraction for plasma lipidomics analysis by liquid chromatography mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 2017;1063:93–100.
2. Quehenberger O., et al. Lipidomics reveals a remarkable diversity of lipids in human plasma. Journal of Lipid Research. 2010;51(11):3299–3305.
3. Xie X., et al. Multicolumn nanoflow liquid chromatography with Accelerated offline gradient generation for robust and sensitive single‑cell proteome profiling. Analytical Chemistry. 2024;96(26):10534–10542.
4. Kreimer S., et al. High‑throughput single‑cell proteomic analysis of organ‑derived heterogeneous cell populations by nanoflow dual‑trap single‑column liquid chromatography. Analytical Chemistry. 2023;95(24):9145–9150.
5. Goracci L., et al. MARS: a multipurpose software for untargeted LC–MS‑based metabolomics and exposomics. Analytical Chemistry. 2024;96(4):1468–1477.
6. LIPID MAPS: update to databases and tools for the lipidomics community. Nucleic Acids Research. 2023;52:D1677–D1682.
7. Peng B., et al. LipidCreator workbench to probe the lipidomic landscape. Nature Communications. 2020;11:2057.