MULTI-OMICS ANALYSES OF FECAL EXTRACTS TO EXPLORE THE MICROBIOME OF RATS FOLLOWING ADMINISTRATION OF AN AGONIST FOR THE GPR40 RECEPTOR

Význam tématu

Studium vlivu farmak na střevní mikrobiom a vzájemných interakcí mezi léčivy a mikrobiální komunitou je klíčové pro pochopení variability účinnosti a toxicity léků. Fasiglifam (TAK-875), agonista GPR40 vyvíjený pro léčbu diabetu 2. typu, vykázal během klinického vývoje signály jaterní toxicity a zprávy ukázaly, že většina jeho metabolitů je vylučována fekálně. Multi-omics analýza fekálních extraktů (proteomika + metabolomika/lipidomika) poskytuje integrovaný pohled na změny mikrobiomu a hostitelských biologických drah po expozici léku, což pomáhá objasnit možné mechanismy toxicity a dysbiózy.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo zmapovat změny v mikrobiomu a souvisejících biochemických profilech potkanů po podání fasiglifamu a identifikovat možné biologické procesy a biomarkery související s dysbiózou a stresem. Použit byl model Sprague Dawley potkanů s různými režimy podání (intravenózně a perorálně) a sběrem fekálních vzorků v časových bodech až do 96 hodin.

Použitá metodika

Popis studie a příprava vzorků:

• Subjekty: 24 potkanů (15 samců, 9 samic), aklimatizace, následné individuální chování po dobu 96 h.
• Dávkování: IV 5 mg/kg; PO 10 mg/kg a 50 mg/kg; zahrnuty skupiny recepčních vozidel jako kontroly.
• Sběr: fekální vzorky ve čtyřech časových bodech od před dávkou do 96 h.

Příprava extraktů a analytika:

• Metabolity: polarové extrakty připravené pomocí modifikovaného Folch protokolu; lipidomika rovněž prováděna z lipidových frakcí.
• Proteiny: extrakce z méně než 10 mg fekálního materiálu, redukce, alkylace a tryptické štěpení pomocí FASP (filter-aided sample preparation).
• Analytické platformy: LC–MS metody s ion mobility (cyklický IMS, HDMSE) pro metabolomiku a SONAR Pulse stepped quadrupole DIA pro hloubkovou proteomiku.
• Zpracování dat: peak picking, normalizace, statistická analýza (ANOVA, PCA, hierarchické shlukování) a přísná kurace identifikací (pro proteiny i metabolity).

Použitá instrumentace

• Xevo MRT P10 (pro vysokou citlivost a přesnost hmotnosti).
• ACQUITY UPLC (kombinace s Xevo pro chromatografické oddělení).
• Cyclic IMS (ion mobility separace, HDMSE režimy) pro 3D analýzu (retence × m/z × drift time).
• SONAR Pulse (stepped quadrupole DIA) pro systematické a reprodukovatelné získávání proteomických dat.
• Informační softwarové nástroje: mzML export, Progenesis, Metacore pro mapování drah a další pipeline pro metaproteomiku/metabolomiku.

Hlavní výsledky a diskuse

Metaproteomika:

• Bylo identifikováno více než 1500 unikátních proteinových ID z méně než 10 mg fekálního materiálu, což ukazuje vysokou citlivost a hloubku metaproteomického přístupu.
• Taxonomické složení mikrobiomu detekované z proteinových dat ukázalo čtyři hlavní fyla; primárně Firmicutes následované Bacteroidetes. Po podání fasiglifamu došlo k výraznému snížení Firmicutes a částečnému snížení Bacteroidetes, zatímco relativní zastoupení Proteobacteria vzrostlo.
• Mapování proteinů na biologické dráhy naznačilo poruchy mitochondriální funkce a zvýšení procesů spojených se stresem a metabolismem, což korelovalo se známkami dysbiózy.

Metabolomika / lipidomika:

• Profil metabolitů a lipidů vykazoval komplexní změny v různých třídách sloučenin mezi kontrolami a dávkovanými skupinami.
• Statistické analýzy (PCA, shlukování) ukázaly dobrou technickou opakovatelnost QC vzorků a jasné časové trajektorie u dávkovaných zvířat; zaznamenána byla také diurnální (denní) variabilita některých metabolitů.
• Jedním z nejvýznamnějších diferencovaných metabolitů byl kortizol, jehož časový průběh koreloval s proteiny spojenými s metabolismem a reakcí na stres.

Integrace dat:

• Kombinace metaproteomických a metabolomických dat ukázala souvislost mezi zvýšením kortizolu, indikátory stresu/metabolického narušení a nárůstem Proteobacteria, což podporuje hypotézu, že lék indukuje stav podporující dysbiózu a zánětlivé procesy.

Přínosy a praktické využití metody

• Ukázaná multi-omics workflow dokáže ze skromného množství fekálního materiálu poskytnout hluboký pohled na mikrobiom i hostitelské reakce, což je cenné pro toxikologii, vývoj léčiv a farmakometabolomiku.
• Metoda umožňuje identifikovat časově závislé změny a spojení mezi metabolity (např. hormonálními markery) a proteiny mikrobiomu, čímž přispívá k mechanistickému pochopení nežádoucích účinků léků.
• Vysoká technická reprodukovatelnost a citlivost LC–MS platformy (Xevo MRT P10 + SONAR Pulse) umožňují robustní profilování i při nízkých množstvích vzorku.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření studií na longitudinální a větší kohorty, včetně lidských vzorků, by zvýšilo translační relevanci a umožnilo validaci nalezených biomarkerů.
• Integrace dalších omik technik (metagenomika, metatranskriptomika) by zlepšila schopnost přiřadit funkce konkrétním taxonům a objasnit příčinné vztahy.
• Využití přesnějších kvantitativních přístupů a standardizovaných referencí pro lipidy a metabolity pomůže snížit „dark matter“ ve výsledcích metabolomiky.
• Analýza interakcí mezi lékovými metabolity přítomnými ve fekáliích a mikrobiálními enzymy může odhalit mechanizmy zodpovědné za lokalizovanou toxicitu (např. jaterní nebo střevní efekty).

Závěr

Multi-omics analýza fekálních extraktů po podání fasiglifamu u potkanů odhalila výrazné změny v mikrobiomové struktuře (pokles Firmicutes, nárůst Proteobacteria), metabolické a stresové odpovědi včetně elevace kortizolu a známky mitochondriální dysfunkce. Kombinace metaproteomiky a metabolomiky poskytla konzistentní obraz dysbiózy a souvisejících biologických procesů, což podtrhuje hodnotu integrovaných přístupů při hodnocení bezpečnosti léčiv a studiu mikrobiom–host interakcí.

Reference

1. Baniasad M.; Kim Y.; Shaffer M.; Sabag-Dalgle A.; Lelelwt I.; Daly R. A.; Ahmer B. M. M.; Wrighton K. C.; Wysocki V. H. Optimization of proteomics sample preparation for identification of host and bacterial proteins in mouse feces. Anal. Bioanal. Chem. 2022, 414:2317–2331. DOI: 10.1007/s00216-022-03885-z.
2. Kogame A.; Lee R.; Pan L.; Sudo M.; Nonaka M.; Moriya Y.; Higuchi T.; Tagawa Y. Disposition and metabolism of the G protein-coupled receptor 40 agonist TAK-875 (fasiglifam) in rats, dogs, and humans. Xenobiotica 2019, 49(4):433–445. DOI: 10.1080/00498254.2018.1453100.
3. Molloy B. J.; King A.; Gethings L. A.; Plumb R. S.; Mortishire-Smith R. J.; Wilson I. D. Investigation of the pharmacokinetics and metabolic fate of Fasiglifam (TAK-875) in male and female rats following oral and intravenous administration. Xenobiotica 2023, 53(2):93–105. DOI: 10.1080/00498254.2023.2179952.
4. Otieno M. A.; Snoeys J.; Lam W.; Ghosh A.; Player M. R.; Pocai A.; Salter R.; Simic D.; Skaggs H.; Singh B.; et al. Fasiglifam (TAK-875): Mechanistic Investigation and Retrospective Identification of Hazards for Drug Induced Liver Injury. Toxicol. Sci. 2018, 163(2):374–384. DOI: 10.1093/toxsci/kfx040.
5. Peisl B. Y. L.; Schymanski E. L.; Wilmes P. Dark matter in host-microbiome metabolomics: Tackling the unknowns — A review. Anal. Chim. Acta 2018, 1037:13–27. DOI: 10.1016/j.aca.2017.12.034.
6. Srivastava A.; Yano J.; Hirozane Y.; Kefala G.; Gruswitz F.; Snell G.; Lane W.; Ivetac A.; Aertgeerts K.; Nguyen J.; et al. High-resolution structure of the human GPR40 receptor bound to allosteric agonist TAK-875. Nature 2014, 513(7516):124–127. DOI: 10.1038/nature13494.
7. Want E. J.; Wilson I. D.; Gika H.; Theodoridis G.; Plumb R. S.; Shockcor J.; Holmes E.; Nicholson J. K. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS. Nat. Protoc. 2010, 5(6):1005–1018. DOI: 10.1038/nprot.2010.50.
8. Wilson I. D.; Nicholson J. K. Gut microbiome interactions with drug metabolism, efficacy, and toxicity. Transl. Res. 2017, 179:204–222. DOI: 10.1016/j.trsl.2016.08.002.
9. Wishart D. S.; Guo A.; Oler E.; Wang F.; Anjum A.; Peters H.; Dizon R.; Sayeeda Z.; Tian S.; Lee B. L.; et al. HMDB 5.0: the Human Metabolome Database for 2022. Nucleic Acids Res. 2022, 50(D1):D622–D631. DOI: 10.1093/nar/gkab1062.