O-Antigen Typing of Escherichia coli by MALDI-TOF MS Analysis of O-Antigen Polysaccharides

Význam tématu

Typizace bakterií je klíčová pro identifikaci původců infekcí, epidemiologické sledování a bezpečnost potravin. U Escherichia coli je jedním z hlavních typizačních markerů O-antigen, polysacharidová složka lipopolysacharidu (LPS) na povrchu buňky. Tradiční O-serotypizace využívá antisera a je pracná a nákladná vzhledem k existenci více než 180 různých O-seskupení. Analýza O-antigenů pomocí MALDI-TOF MS nabízí možnost rychlé, levnější a standardizované alternativa založenou na měření hmotností opakujících se jednotek polysacharidů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ověřit, zda lze typ O-antigenu E. coli určit na základě masových spektrálních vzorců O-antigenových polysacharidů získaných metodou MALDI-TOF MS. Autoři testovali přístup na typech a klinických (lidských) izolátech enterohemoragických E. coli (EHEC) tří často se vyskytujících O-serogroup: O157, O26 a O103, a porovnali zjištěné periodické intervaly v hmotnostních spektrech s teoretickou molekulovou hmotností opakující se monosacharidové jednotky.

Použitá metodika a instrumentace

Postup přípravy vzorku:

• Kolonie pěstované na agarovém médiu Luria-Bertani suspendovány v čisté vodě a zahřáty na 90 °C po dobu 10 minut.
• Po centrifugaci byl k pelletu přidán HCl (konečná 100 mM) a NaCl (25 mM), poté opět zahřátí na 90 °C po 10 minutách; supernatant sloužil jako roztok O-antigenových polysacharidů.
• Na MALDI destičku bylo naneseno 1,0 µL vzorku a po zaschnutí 1,0 µL matrice (2,5-dihydroxybenzoová kyselina, DHB, 1,25 mg/mL v 50 % acetonitrilu).

Instrumentace a analytické parametry:

• MALDI-TOF MS: benchtop systém MALDI-8020 (benchtop linear MALDI-TOF).
• Režim: linear positive.
• m/z rozsah měření: 500–10000.
• Matrice: DHB.
• Pulsed extraction (PE): 2300 Da.
• Repetiční frekvence: 200 Hz; laser intensity: 85.
• Laserové skenování: 5 záblesků × 256 profilů, rasterované body (1000 × 1000 µm, spacing 50 µm).

Hlavní výsledky a diskuse

Hlavní pozorování:

• Ve spektru O157 se objevily periodické píky s m/z 1438.9, 2137.5, 2836.0 a 3534.6, navzájem vzdálené o ~698–699 Da, což odpovídá vypočtené molekulové hmotnosti opakující se jednotky O157 (cca 698.7 Da).
• U O26 se vyskytovaly periodické intervaly ~536–537 Da, v souladu s teoretickou hmotností opakující se jednotky O26 (cca 536.5 Da).
• U O103 byly periodické intervaly ~1002–1003 Da, opět konzistentní s vypočtenou hmotností opakující se jednotky O103 (cca 1003.0 Da).
• Tento vzor opakujících se píků byl pozorován konzistentně jak u typových kmenů, tak u lidských EHEC izolátů pro všechny tři testované serotypy.

Interpretace:

• O-antigen polysacharid je polymer složený z opakujících se monosacharidových jednotek; MALDI-TOF MS umožňuje detekovat tyto polymery jako sérii píkových řad s opakujícím se rozdílem odpovídajícím hmotnosti jedné repeatu.
• Porovnáním naměřených intervalů s vypočtenými hmotnostmi repetitních jednotek lze přiřadit O-serotyp bez použití antisér — metoda tak funguje jako „glycotypizace“ pomocí MS.
• Metoda byla demonstrována na vybraných EHEC serogrupech, což podporuje použitelnost přístupu, avšak rozsah validace je zatím omezený na tři serotypy.

Přínosy a praktické využití metody

Výhody navrhované metody:

• Rychlost a jednoduchost: analýza v jediné uskutečněné MALDI analýze s jednou matricí bez potřeby množství antisér.
• Snížení nákladů: eliminace nebo významné omezení potřeby drahých antiserum reagencií a pracovně časově náročné imunologické typizace.
• Škálovatelnost: potenciál pro rychlé screenování velkého počtu izolátů v rutinních laboratořích disponujících MALDI-TOF přístrojem.

Omezení a rizika:

• Metoda detekuje hmotnostní rozdíly repetitních jednotek; odlišení velmi podobných struktur může být náročné, zvláště když jsou repetitní jednotky isobarické nebo modifikované.
• Testováno pouze na třech serogrupech; pro plnou aplikaci na >180 O-seskupení je nutná rozsáhlá databáze spektrálních vzorů a validace.
• Matrice, ionizační podmínky a kvalita přípravy vzorku mohou ovlivnit kvalitu spekter a interpretaci opakujících se řad.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje a aplikace:

• Rozšíření spektrálních databází O-antigenů napříč širokým spektrem E. coli O-seskupení pro umožnění rutinního automatického přiřazení serotypu.
• Integrace s bioinformatickými nástroji pro automatickou detekci periodických intervalů a porovnání s referenčními hmotnostmi repetitních jednotek.
• Možná kombinace s dalšími analytickými přístupy (např. tandemová MS, permethylace, enzymatická digesce) pro zvýšení specifity a rozlišení isobarických opaků.
• Použití v epidemiologickém monitoringu potravinových nákaz a v rutinním testování v nemocničních nebo veřejnozdravotních laboratořích jako doplněk nebo alternativu k antisérům založené typizaci.

Závěr

Autoři prokázali, že MALDI-TOF MS analýza O-antigenových polysacharidů dokáže rozlišit vybrané O-serotypy E. coli (O157, O26, O103) podle periodických rozdílů m/z odpovídajících molekulovým hmotnostem repetitivních monosacharidových jednotek. Metoda nabízí rychlou, relativně jednoduchou a nákladově výhodnou alternativu k tradiční O-serotypizaci založené na antiserech, přičemž další validace a rozšíření databáze jsou nutné pro široké nasazení napříč všemi O-seskupeními.

Reference

1. Jigyo Nenpo (Osaka Institute of Public Health, FY2023). Annual report of Osaka Institute of Public Health, 2023.
2. Shogo U, Hiroshi H. MALDI glycotyping of O-antigens from a single colony of gram-negative bacteria. Scientific Reports. 2024;14:12719. Doi:10.1038/s41598-024-62729-1. PMID:38830875. PMCID:PMC7685785.
3. Liu B, Furevi A, Perepelov AV, Guo X, Cao H, Wang Q, Reeves PR, Knirel YA, Wang L, Widmalm G. Structure and genetics of Escherichia coli O antigens. FEMS Microbiology Reviews. 2020;44(6):655-683. Doi:10.1093/femsre/fuz028. PMID:31778182.