Elucidating the Fine Structure of Fructan Isomers in Agave using Cyclic Ion Mobility Mass Spectrometry

Elucidace jemné struktury izomerů fruktanů z agáve pomocí cyklické iontové mobilitní hmotnostní spektrometrie

Význam tématu

Fruktany (oligo- a polysacharidy založené na fruktóze) v rostlinách Agave hrají roli v adaptaci na stres a mají ekonomický význam například v produkci tequily a potravinářství. Jejich molekuly s daným stupněm polymerace (DP) často existují jako směs strukturních izomerů, které jsou obtížně rozlišitelné klasickými chromatografickými nebo hmotnostními metodami. Iontová mobilita (IMS) umožňuje měřit kolizní průřez (CCS), fyzikálně-chemický parametr citlivý na tvar a konformaci iontů, a tím zvyšuje schopnost rozlišit izomery. Studie ukazuje integraci experimentálně naměřených CCS s teoretickými výpočty pro přiřazení struktur fruktanových izomerů z agáve.

Cíle a přehled studie / článku

• Izolovat fruktany z Agave tequilana a oddělit frakce podle stupně polymerace (DP).
• Zkoumat jemnou izomerii u komponenty s DP4 pomocí cyklické iontové mobility (cIMS) a LC-IMS-MS.
• Srovnat experimentální hodnoty CCS (CCSe) s teoreticky vypočtenými hodnotami (CCSt) pro možné strukturální izomery, aby bylo možné strukturálně přiřadit pozorované komponenty.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorek: vodný extrakt z kmene šestileté Agave tequilana; frakcionace podle velikosti pomocí gelové permeační chromatografie (Size Exclusion Chromatography) na sloupci BioGel P2 s vodou jako eluční fází; frakce byly lyofilizovány a složení DP ověřeno hmotnostním spektrometrem SYNAPT HDMS.
• Iontová mobilita: SELECT SERIES Cyclic IMS System provedení multipass experimentů pro zvýšení rozlišovací schopnosti IMS; CCSe kalibrovány pomocí Major Mix kalibrace.
• Chromatografie: ACQUITY UPLC se sloupcem Atlantis Premier BEH C18 AX (1.7 µm, 2.1 x 150 mm) pro LC-IMS-MS separace.
• Teoretické výpočty: možné struktury fruktanů modelovány ab initio, 3D optimalizovány a jejich CCSt vypočteny Trajectory Method v softwaru IMoS v1.10.
• Sledované analytické postupy: infusionové měření s více průchody cIMS (multipass), tzv. slicing experimenty pro izolaci a další separaci složek, a LC-MS/MS pro potvrzení retenčních časů a fragmentace; srovnání CCSe a CCSt pro přiřazení struktur.

Hlavní výsledky a diskuse

• U komponenty DP4 (m/z 665) získané infusionem bylo po 6 průchodech cIMS pozorováno šest distinktivních komponent podle rozdílných arrival time distributions (ATD). Toto ukazuje výraznou vnitřní izomerní složitost i pro nízký DP.
• Slicing experimenty (izolace skupin iontů a další průchody) vedly po dalších 12 průchodech v téměř baseline separaci vybraných skupin, což potvrdilo, že multipass cIMS významně zvyšuje rozlišovací schopnost pro tyto izomery.
• V kombinaci LC a cIMS (LC-cIMS) se zvýšila peak capacity a bylo detekováno až 8 komponent ve srovnání se 6 z infusion-only experimentu; LC tak odhalil další chromatografické rozlišení izomerů, které by bylo jinak skryté.
• Srovnání experimentálních CCSe a vypočtených CCSt ukázalo dobré shody: rozdíly mezi CCSe a CCSt pro jednotlivé peaky se pohybovaly v rozmezí přibližně 1–3 %. Konkrétně, standard Nystose (komerčně dostupný DP4 izomer) vykázal CCSe ≈ 231.16 Å2 a CCSt ≈ 228.9 Å2 (rozdíl ~1 %), což spolu s identickým retenčním časem a souhlasem MS/MS fragmentace potvrdilo správné přiřazení této struktury k jedné z pozorovaných komponent.
• Tento přístup (experimentální CCS + modelování) umožnil přiřadit pořadí izomerů: nejkratší ATD odpovídal nejmenšímu teoretickému CCS a trend byl konzistentně šířen pro ostatní komponenty, čímž se podpořila věrohodnost přiřazení struktur.

Přínosy a praktické využití metody

• Integrace cIMS s LC a teoretickými výpočty CCS poskytuje robustní cestu k diferenciaci a strukturálnímu přiřazení fruktanových izomerů, které jsou jinak těžko rozlišitelné.
• Metoda umožňuje podrobné profilování fruktanových směsí z rostlinných materiálů, což je důležité pro výzkum fyziologie rostlin, šlechtění pro odolnost ke stresu a zlepšování surovin pro průmyslové aplikace.
• Pro analytické laboratoře a průmyslové QC představuje LC-cIMS kombinace nástroj s vyšší selektivitou a citlivostí pro kontrolu kvality a identifikaci specifických izomerů v komplexních saccharidových matricích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření CCS databází pro široké spektrum fruktanových struktur a jejich konformací umožní rychlejší a automatizované přiřazování v rutinních analýzách.
• Kombinace s vyššími výpočetními metodami (např. lepší popis solvatace, dynamické simulace) zvýší přesnost CCSt a tím sníží nepřesnosti při porovnání s experimentem.
• Vyšší multipass kapacity a pokročilé IMS režimy by mohly dále zlepšit rozlišení velmi podobných izomerů, zejména v kombinaci s orthogonálními separačními technikami (např. ion-neutral reactivity, derivatizace cíleně měnící CCS).
• Možnost aplikace přístupu na další oligosacharidové a glykanové systémy v potravinářství, biotechnologii a metabolomice.

Závěr

Studie demonstruje, že spojení experimentálně naměřených CCS získaných pomocí SELECT SERIES Cyclic IMS a teoretických CCS z Trajectory Method modelů umožňuje spolehlivé rozlišení a přiřazení izomerů fruktanů z agáve. Multipass cIMS významně zvyšuje rozlišovací schopnost a v kombinaci s LC odhaluje více komponent, než umožní samotný infusion cIMS. Identifikace Nystose jako jedné z komponent (shoda v RT, MS/MS a CCS do ~1 %) potvrzuje validitu přístupu. Tento integrovaný workflow je vhodný pro detailní strukturální mapování komplexních sacharidových směsí a má širší aplikační potenciál v analytické chemii a průmyslové kontrole kvality.

Použitá instrumentace

• SYNAPT HDMS System (Waters) – ověření DP složení frakcí.
• SELECT SERIES Cyclic IMS System (Waters/Cyclic Instrument) – multipass iontová mobilitní separace a měření ATD/CCS.
• ACQUITY UPLC (Waters) s Atlantis Premier BEH C18 AX, 1.7 µm, 2.1 x 150 mm – chromatografická separace před IMS-MS.
• BioGel P2 (Bio-Rad) kolona pro Size Exclusion Chromatography (SEC) při přípravě frakcí.
• IMoS v1.10 (Trajectory Method) – výpočet teoretických CCS z ab initio 3D modelů.

Reference

1. Coots J., Gandhi V., Onakoya T., Chen X., Larriba-Andaluz C. A parallelized tool to calculate the electrical mobility of charged aerosol nanoparticles and ions in the gas phase. Journal of Aerosol Science, 2020, 147, 105570.