Automated Preparative Purification Using Nexera UFPLC

Význam tématu

Preparativní kapalinová chromatografie (LC) je klíčová pro průmysl farmaceutický, potravinářský a chemický při izolaci cílových sloučenin, screeningu aktivních složek a identifikaci neznámých nebo kontaminujících látek. Hlavní praktický problém klasických reverzních preparativních metod spočívá v tom, že frakce jsou shromažďovány ve vodném mobilním fázi a nízké koncentraci, což prodlužuje následné sušení a přípravu práškových produktů. Prezentovaný systém Nexera UFPLC řeší tento problém kombinací frakcionace s online koncentračním (trap) stupněm a automatizovaným elučním postupem do organického rozpouštědla, čímž zkracuje čas a nároky na post-purifikační zpracování.

Cíle a přehled studie / článku

Studie demonstruje automatizované záchytné koncentrování a následné eluování cílové látky (modelově Hydrokortisonu) pomocí systému Nexera UFPLC. Cíle byly: (1) ukázat, že opakovaným nahráváním frakcí na trap kolonu lze dosáhnout vysokých koncentrací, (2) prokázat eluování v organickém rozpouštědle (acetonitril) pro snížení doby sušení, (3) demonstrovat nezávislost koncentrace nasbírané frakce na tvaru píku (tj. i při tailingu) a (4) ilustrovat plně automatizovaný pracovní postup řízený softwarem Purification Solution.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika kombinovala preparativní separaci s on-line zachycením na trap kolonu a následným promytím a eluováním organickým rozpouštědlem. Klíčové kroky: (1) separace na preparativním sloupci, (2) zachycení cílové látky na trap kolonu při současném dodání vody z dilution pumpy pro udržení retence, (3) promytí trap kolony k odstranění iontových a nevolatilních nečistot, (4) eluování acetonitrilem a sběr vysoce koncentrované frakce. Operační možnosti zahrnovaly opakované injekce na tentýž trap pro navýšení nashromážděné hmoty.

Klíčová instrumentace (shrnutí):

• Systém: Nexera UFPLC (Shimadzu) se softwarem Purification Solution.
• Préparativní čerpadla: LC-20AP (prep a dilution), LC-40D (elution/makeup).
• Detekce: UV detektory SPD-M40 (prep) a SPD-40V (elution), MS detektor LCMS-2050 (ESI/APCI DUIS, pozitivní režim, SCAN m/z 100–500, SIM pro m/z 363.1).
• Frakcionátor / autosampler: LH-40 (fraction collector / auto sampler).
• Ventily: FCV-12AH pro přesměrování toků.
• Kolony: Shim-pack Scepter C18-120 prep column (150×20 mm, 5 µm); trap kolona Shim-pack UFPLC (30×20 mm, 20–30 µm).
• Příklady provozních parametrů: preparativní průtok 20 mL/min; dilution (voda) 80 mL/min; makeup/metanol 1.5 mL/min; eluční acetonitril 9 mL/min; typické injekce 2 mL s možností opakování.

Hlavní výsledky a diskuse

Experimenty s mixem sedmi malých molekul (cílově Hydrokortison) prokázaly, že Nexera UFPLC dosahuje výrazně vyšších koncentrací sesbíraných frakcí a umožňuje eluování výhradně do organického rozpouštědla:

• Hydrokortison: srovnání preparativní LC vs UFPLC ukázalo nárůst koncentrace frakce z ~500 mg/L (prep LC; 36 % ACN/water, objem 20 mL) na ~1111 mg/L (UFPLC; 100 % ACN, objem 27 mL) — přibližně 2,2× zvýšení koncentrace.
• Papaverin: pro příklad se špatně tvarovaným pikem (tailing) došlo ke zlepšení z ~17 mg/L (prep LC; průtok 20 mL/min, objem 60 mL) na ~111 mg/L (UFPLC; průtok 9 mL/min, objem 9 mL) — ~6,5× zvýšení.
• Opakované nahrávání na trap (ukázka 3×) vedlo ke kumulaci cílového analytu a vyššímu konečnému koncentrátu při eluování.
• Analytické ověření čistoty a návratnosti u Hydrokortisonu poskytlo vysoké hodnoty (čistota ≈ 100 % area, návratnost ≈ 100.7 %), což indikuje minimální ztráty při workflow.

Diskuse zdůrazňuje, že hlavní přínos plyne z oddělení kroku separace a finálního shromáždění: trap kolona izoluje a koncentruje analyty, umožňuje selektivní odsolení/promytí a následné eluování do čistého organického rozpouštědla bez rozředění vodou z mobilní fáze. Navíc integrace MS signálu jako triggeru zvyšuje spolehlivost frakcionace u komplexních směsí.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické výhody Nexera UFPLC zahrnují:

• Výrazné zkrácení času a operací při sušení a přípravě práškových vzorků díky eluaci do organického rozpouštědla.
• Možnost získat vysoké koncentrace i při kompromisních separačních podmínkách (např. tailing), což zjednodušuje izolaci cílové látky v přítomnosti blízkých nečistot.
• Automatizace celého procesu (frakcionace, koncentrace, proplach, eluace) s vizuální kontrolou chromatogramů a trap pozic v jednom GUI, čímž se snižuje pracovní náročnost a chyba obsluhy.
• Eliminace/nepřímé odstranění nevolatilních solí a kontaminantů před finálním eluováním.
• Využití v rutinních izolacích malých molekul, screeningových kampaních, přípravě materiálu pro strukturální analýzy nebo toxikologii a v procesu purifikace u vývoje API.

Budoucí trendy a možnosti využití

Potenciální směry dalšího rozvoje a aplikací zahrnují:

• Integraci sofistikovanějších trap materiálů (specifické fáze, ion-exchange, mixed-mode) pro širší třídu látek včetně polárních a ionizovatelných analyzátů.
• Pokročilou automatizaci řízenou MS-datovým tokem (víceúrovňové rozhodování o frakcionaci na základě reálného času MS spektra).
• Škálovatelnost procesu – kombinace s kontinuálními nebo semi-preparativními režimy pro větší hmotnostní nároky.
• Optimalizaci solventní spotřeby a „zelenější“ pracovních postupů díky cílenému eluování do menších objemů organických rozpouštědel.
• Rozšíření použití na přírodní produkty, impurity profiling a izolaci metabolitů v biomedicínském výzkumu.

Závěr

Nexera UFPLC představuje efektivní řešení pro automatizované koncentrování a sběr preparativních frakcí v organickém rozpouštědle díky on-line trap koloně a řízenému workflow. Metoda umožňuje vyšší koncentrace sesbíraných látek, zkracuje post-purifikační kroky a je méně citlivá na nepříznivé tvary píků. Integrace UV a MS signálů a možnost opakovaných nahrání činí systém užitečným nástrojem pro izolaci malých molekul v laboratořích zaměřených na vývoj a kontrolu kvality.

Reference

Fujisaki S., Shimadzu Corporation, Application News: Automated Preparative Purification Using Nexera UFPLC — High Concentration Collection via an Online Trap Column, First Edition, May 2026.