Automated in-needle OPA/FMOC derivatization of amino acids analysis with the Thermo Scientific Vanquish Core HPLC system operated under Empower 3.8.0 CDS

Automatizovaná in-needle OPA/FMOC derivatizace aminokyselin a její integrace do prostředí Empower 3.8.0 na systému Thermo Scientific Vanquish Core

Význam tématu

Analýza aminokyselin (AAs) je klíčová v biologii, potravinářství, zemědělství i průmyslové kontrole kvality. Mnohé aminokyseliny samy o sobě nevykazují dostatečnou absorbanci nebo fluorescenci pro citlivou detekci v RP-HPLC, proto se běžně používá prekolonní derivatizace (např. OPA pro primární a FMOC-Cl pro sekundární aminokyseliny). Automatizace této derivatizace minimalizuje variabilitu, snižuje čas náročný na práci a zvyšuje reproducibilitu analýz, což je kritické pro rutinní laboratoře a velká sekvenční měření.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo ukázat realizovatelnost a jednoduchost implementace plně automatizovaného in-needle OPA/FMOC derivatizačního pracovního postupu pro aminokyseliny na Vanquish Core HPLC systému připojeném a řízeném prostřednictvím Waters Empower 3.8.0 CDS s využitím pluginu SII for Empower 1.3. Studie demonstruje nastavení cibílového (custom) injekčního programu (CIP), automatizovanou přípravu směsí v jehle autosampleru a následnou chromatografickou analýzu fluorescenčně detekovaných derivátů na Accucore C18 kolóně. Jako příklad byl zpracován kalibrační standard (75 µM) a testovací vzorek (sójová omáčka, ředěný 1:1000).

Použitá metodika

- Princip: Prekolonní in-needle derivatizace dvou skupin aminokyselin - primární AAs jsou derivatizovány OPA za přítomnosti merkaptanu (MPA) za vzniku fluorescenčních produktů; sekundární AAs jsou derivatizovány FMOC-Cl. Reakce se následně zruší (quench) kyselinou (ocetová kyselina). Borátový pufr pH ≈10 se používá pro optimální průběh reakce.
- Workflow: Autosampler provádí sekvenci nasátí reagenčních roztoků a vzorku přímo do jehly, provede mísení a inkubaci pro derivatizaci, následně je injektován analyzovaný roztok do chromatografického systému. Pro konfiguraci byla použita možnost Custom Injection Program (CIP) v módu Replace normal injection v rámci instrument method editoru pluginu SII for Empower.
- Detekce: Fluorescenční detekce s dvojím optimalizovaným spektrem pro produkty OPA/MPA (ex. 337 nm / em. 442 nm) a FMOC (ex. 260 nm / em. 325 nm). Kvantifikace v Empower byla prováděna pomocí kalibrační křivky s kvadratickým fitováním (příklad pro tyrosin), s možností upravit komponenty a typ fitu v processing nastavení.

Použitá instrumentace

- Thermo Scientific Vanquish Core HPLC systém s následujícími moduly: System Base Vanquish Core, Vanquish Quaternary Pump C, Vanquish Split Sampler CT s 100 µL nerezovými vzorkovacími smyčkami, Column Compartment C s pasivním předehřívačem a 5 µL kapilárou, Vanquish Fluorescence Detector F (D-PMT) s biokompatibilní flow cell 8 µL.
- Kolona: Thermo Scientific Accucore C18, 3 × 150 mm, 2.6 µm; ochraná cartridge Accucore C18 3 × 10 mm, 2.6 µm v Unigard přímém držáku.
- Spotřební materiál: SureSTART 2 mL amber vial (vzorkové lahvičky), další běžné laboratorní reagence pro přípravu OPA, MPA, FMOC-Cl, borátového pufru (pH 10) a acetic acid pro quench.
- Software: Waters Empower CDS verze 3.8.0 pro řízení a zpracování dat; Thermo Scientific SII for Empower plugin verze 1.3 pro plnou integraci Vanquish modulů do prostředí Empower včetně podpory CIP příkazů. V Empoweru byl použit průvodce (wizard) pro vytvoření instrument method a možnost přidat metodu do method setu.

Hlavní výsledky a diskuse

- Implementace: In-needle derivatizační postup byl úspěšně přenesen do prostředí Empower s pomocí SII pluginu; uživatelské rozhraní Empoweru umožnilo nastavit pumpu, sampler, kolonu a detektor a vložit sekvenci CIP příkazů pro automatické mísení a derivatizaci.
- Chromatografické výsledky: Bylo dosaženo separace všech testovaných aminokyselin při použití Accucore C18 kolony. Ukázková chromatografie obsahovala kalibrační směs 75 µM (obsahující testované AAs ve stejných koncentracích) a reálný potravinářský vzorek (sójová omáčka), kde byly analyty detekovány po ředění 1:1000.
- Kvantifikace: Pro kvantifikaci sloužil kalibrační model s kvadratickým fitováním (příklad tyrosinu). Empower umožnil snadné přizpůsobení seznamu komponent, typu fitu a následné revize vzorkových výsledků v data review okně.
- Robustnost a reprodukovatelnost: Automatizace in-needle derivatizace snížila manuální zásahy a variabilitu pozorovanou u manuálních postupů; použití plně řízené sekvence v autosampleru zvyšuje opakovatelnost a usnadňuje rutinní provoz v multi-vendor prostředí.

Přínosy a praktické využití metody

- Zvýšená produktivita: Plně automatizovaný postup snižuje čas potřebný pro manuální přípravu vzorků a umožňuje vyšší průtok vzorků v rutinních laboratořích.
- Lepší reprodukovatelnost: Kontrolované nasávání a míchání v jehle minimalizuje chyby spojené s ručním dávkováním a expozicí reagenčních roztoků.
- Kompatibilita softwaru: Podpora Vanquish systémů v Empower prostřednictvím SII pluginu umožňuje integraci do laboratoří používajících software Waters bez nutnosti měnit laboratorní CDS.
- Široké použití: Metoda je vhodná pro potravinářské analýzy, controlní testy v průmyslu, výzkum metabolomiky nebo kontrolu kvality vstupních surovin, kde jsou potřeba spolehlivé profily aminokyselin.

Budoucí trendy a možnosti využití

- Rozšíření automatizace: Další automatizační kroky (např. integrace s automatickými činidlovými zásobníky, robotizovanými systémy pro ředění) mohou dále snížit lidský zásah a zvýšit propustnost.
- Adaptace pro LC–MS: I když je současná práce zaměřena na fluorescenční detekci, obdobné in-needle derivatizační workflow lze přizpůsobit pro hyphenované techniky (HPLC–MS) za účelem získání strukturovaných informací a vyšší selektivity.
- Standardizace a validace: Zavedení validovaných protokolů a mezi-laboratorní porovnání by podpořilo širší adopci této automatizované metody v regulovaných prostředích.
- Pokročilá datová analýza: Integrace s pokročilými datovými nástroji a LIMS zajistí lepší správu dat a automatizovanou reportaci výsledků.

Závěr

Implementace plně automatizované in-needle OPA/FMOC derivatizace aminokyselin na systému Thermo Scientific Vanquish Core byla úspěšně provedena v prostředí Waters Empower 3.8.0 s využitím SII for Empower pluginu. Procedura přináší vyšší efektivitu, lepší reprodukovatelnost a dobrou kompatibilitu mezivendorských systémů, což z ní činí vhodnou volbu pro rutinní analýzy aminokyselin ve výzkumu i průmyslu. Podrobné provozní parametry a přípravy standardů jsou uvedeny v referencích a interních metodikách.

Reference

1. Huyn Park S., et al. Thermo Scientific Application Note 73151: Underivatized amino acid analysis in wine by HILIC separation and mass detection, 2019.
2. Bernal Soro A., et al. Thermo Scientific Customer Application Note 003698: Amino acid analysis in food, beverages, and fertilizers by automated in-needle OPA/FMOC derivatization, 2025.
3. Grosse S. Thermo Scientific White Paper 72749: Using Thermo Scientific Vanquish HPLC and UHPLC systems with Waters Empower 3 chromatography data system (CDS), 2022.