High-Speed Amino Acid Analysis (AAA) on 1.8 μm Reversed-Phase (RP) Columns

Význam tématu

Analýza aminokyselin (AAA) je základem biochemické charakterizace proteinů, kvality potravin a kontroly biotechnologických procesů. Znalost přesného složení aminokyselin umožňuje sledovat kvalitu surovin i finálních produktů, podílet se na vývoji nových léků a zabezpečit reprodukovatelnost analytických postupů. Rychlá, citlivá a automatizovaná metoda AAA podporuje vysokou laboratorní produktivitu a splňuje požadavky pro analýzu limitovaných vzorků.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout vysoce efektivní AAA s turn-around časem pod 14 minut, zlepšenou citlivostí a rovnoměrnou reprodukovatelností pro primární i sekundární aminokyseliny. Nově byly využity inovační 1,8 µm C18 částice optimalizované pro provoz na standardních 400 bar HPLC systémech. Kombinace prekolonní derivatizace OPA a FMOC umožnila automatické zpracování vzorků a současnou detekci všech proteinogenních aminokyselin.

Použitá metodika

Prekolonní derivatizace probíhala ve dvou krocích: nejprve OPA reagovala s primárními aminokyselinami za přítomnosti 3-mercaptopropionové kyseliny (citlivé fluorescenční deriváty), poté FMOC modifikoval sekundární aminokyseliny. Oddělení derivátů bylo realizováno lineárním gradientem na C18 kolónách o délce 50 mm a průměrech 2,1, 3,0 a 4,6 mm s částicemi 1,8 µm. Mobilní fáze A byla na bázi fosfát-borátového pufru pH 8,2, fáze B tvořil acetonitril-methanol-voda (45:45:10). Detekce probíhala diodovým polem (DAD) při 230, 262 a 338 nm a fluorescenčním detektorem (FLD) při Ex/Em 230/450 nm a 266/305 nm.

Použitá instrumentace

• Agilent 1200SL HPLC systém: dvoupumpa, degaser, vysokoteplotní autosampler, chromatografická kolona s termostatem
• ZORBAX Rapid Resolution HT Eclipse Plus C18 (2.1×50 mm, 3.0×50 mm, 4.6×50 mm; 1.8 µm)
• Diodový pole (DAD) a fluorescenční detektor (FLD)
• Automatizovaný přípravek pro prekolonní derivatizaci (borátový pufr, OPA, FMOC)

Hlavní výsledky a diskuse

Nová metoda dosahuje turn-around času 13,5 min při průtoku až 2 mL/min (4,6 mm id). Průměrná relativní chyba oblasti píku (RSD) se pohybuje pod 2 % pro všechny aminokyseliny včetně sekundárních. Liniarita kalibračních křivek dosahuje hodnot r^2 >0,998 pro primární i sekundární deriváty. Metoda byla úspěšně aplikována na analýzu komerčních piv, kde se ukázaly rozdíly v profilu aminokyselin odvozené od receptury a technologického postupu.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby analýzy pod 14 min
• Vyrovnaná citlivost a reprodukovatelnost pro všechny aminokyseliny
• Kompatibilita s běžnými HPLC systémy do 400 bar
• Jednoduchá změna průměru kolony změnou průtoku bez nutnosti optimalizace metodiky
• Možnost snadného rozšíření na potravinářskou, farmaceutickou a biotechnologickou analýzu

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj směřuje k integraci AAA do online procesní kontroly (PAT) v biotechnologiích a farmacii, vývoji ještě rychlejších fází a miniaturizaci na mikrofluidní platformy. Využití dalších derivatizačních činidel a multimodálních stacionárních fází umožní širší spektrum analyzovaných vzorků a složitější matice.

Závěr

Popsaná AAA založená na 1,8 µm C18 kolónách představuje technologický posun v rychlosti, citlivosti a reprodukovatelnosti. Automatizace prekolonní derivatizace OPA/FMOC a optimalizované chromatografické podmínky činí metodu robustní, snadno implementovatelnou v běžných laboratořích a připravenou pro náročné aplikace v potravinářství, farmacii i biotechnologii.

Reference

• Schuster R., Apfel A. Hewlett-Packard App. Note, 5954-6257, 1986
• Schuster R. J. Chromatogr., 431, 271–284, 1988
• Godel H., Seitz P., Verhoef M. LC-GC Int., 5(2), 44–49, 1992
• Henderson J. W. et al. Agilent App. Note 5980-1193E, 2000
• Moore S., Stein W. H. J. Biol. Chem., 192, 663–681, 1951
• Roth M. Anal. Chem., 43, 880–882, 1971
• Einarsson S. B. et al. J. Chromatogr., 282, 609–618, 1983
• Betnér I., Földi P. LC-GC Int., 2(3), 44–53, 1989
• Gustavsson B., Betnér I. J. Chromatogr., 507, 67–77, 1990