Optimized Fragmentation of Oligonucleotides Suppresses Undesired Fragmentation Products and Enables Confident Sequence Assignment

Význam tématu

Masové spektrální sekvenování oligonukleotidů je klíčové pro ověřování primárních sekvencí RNA/DNA, analýzu modifikací a kontrolu kvality v biotechnologii a výzkumu. Nicméně konvenční vibrační aktivační metody vedou k četným následným štěpením (internal fragments, base losses) a k více typům produktů, které zhoršují interpretaci tandemových MS spekter. Optimalizace podmínek aktivace, která potlačí tyto nežádoucí produkty a preferuje primární sekvenční fragmenty, zásadně zvyšuje jistotu při přiřazení m/z signálů a rozšiřuje použitelnost MS pro delší a modifikované oligonukleotidy.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat běžné vibrační aktivační techniky (HCD, konvenční CID, IRMPD) a nové nastavení nízkého Mathieu q v ion-trapu (označované jako lqCID) pro štěpení negativně nabitých oligonukleotidů. Autoři testovali vliv snížení q (a tím efektivního omezení nejvyšší kinetické energie srážek) na vznik nežádoucích druhotných fragmentů, na úplnost sekvenčních iontových řad a na míru falešných pozitiv při přiřazení c/y nebo d/w iontových párů. Dále byla ověřena kompatibilita lqCID jako suplementární metody pro rozpad nabitých radikálových intermediátů vznikajících při NETD/EPD (NET-lqCID, EPD-lqCID) a použitelnost metody pro větší oligonukleotidy (20mer, 50mer a extrapolace na ~100mer).

Použitá instrumentace

• Ionizace: negativní statická ESI pomocí zlacených pulled-silica emitérů.
• Spektrometry: Thermo Scientific Orbitrap Ascend Tribrid (s UV laserem 213 nm) a upravený Orbitrap Eclipse Tribrid pro IR aktivaci (10.6 µm).
• Selektivní m/z izolace: kvadrupól, šířka okna 2 Th.
• Aktivační metody a typické nastavení v lineárním kvadrupólovém ion trapu (LIT):
  • Konvenční trap CID: q = 0.25, NCE ~30%, doba 10 ms.
  • lqCID (nové nastavení): q = 0.15, NCE ~20%, doba 30 ms; pro MS3 NET-lqCID/EPD-lqCID použití 15% nebo 10% NCE.
  • IRMPD: q = 0.05, 3 W, 5 ms.
  • NETD / AI-NETD: použití floranthenového reaktantu, doby ~80 ms; AI-NETD přidává IR výkon 1.5 W.
  • HCD: viontová kolizní bunka (ion routing multipole), 8 mTorr N2, 17% NCE.
• Akvizice: Orbitrap detekce; 20mer: 120 000 rozlišení, 100 průměrů; 50mer: 240 000 rozlišení, 300 průměrů.
• Software: Thermo Scientific BioPharma Finder v5.0 (přesnost 10 ppm, 0.5% prahová intenzita), dekonvoluce 50mer pomocí Zscape; manuální validace vybraných iontů.

Metodika a příprava vzorku

Oligonukleotidové standardy (IDT) byly rekonstituovány v MS-grade vodě na 1 µg/µL a dále zředěny na 10 µM v čisté vodě nebo v 50 mM octanu amonném. Prekurzorové ionty vybírané pro studie byly negativně nabité (různé stavy nabití, např. -5 až -13) a analyzovány buď přímo MS2 nebo jako MS3 po NETD/EPD redukci náboje, přičemž NET-lqCID a EPD-lqCID byly použity jako následné disociační kroky pro nabité radikálové nebo nabité redukované produkty.

Hlavní výsledky a diskuse

• lqCID (q = 0.15) výrazně omezil vznik druhotných interních fragmentů a ztrát bází ve srovnání s HCD, konvenčním CID a IRMPD. Spektra jsou díky tomu méně komplexní a převládají „první generace“ sekvenční ionty (c/y pro lqCID, d/w pro NET-lqCID).
• Při analýze RNA 20mer vedly HCD a konvenční CID k více falešným přiřazením c/y párů pro zamaskované nebo palindromické sekvence; HCD a CID vykázaly více falešně pozitivních c/y párů (11 pro HCD/CID, 8 pro IRMPD), zatímco lqCID vykázalo pouze jedno falešné y-ion přiřazení, čímž výrazně zvýšilo spolehlivost sekvenačních závěrů.
• Jako suplementární aktivační metoda (NET-lqCID nebo EPD-lqCID) lqCID účinně rozložilo NETnoD/EPD-intakt produkty vzniklé při NETD/EPD, čímž se dosáhlo bohaté a kompletní série d/w (a v některých případech a•/z•) iontů. EPD-lqCID a NET-lqCID produkovaly prakticky srovnatelná spektra; EPD-lqCID vyžadovalo mírně nižší NCE (~10% vs ~15%).
• Pro RNA 50mer poskytla lqCID MS2 a NET-lqCID MS3 téměř kompletní odpovídající c/y nebo d/w řadu. Překvapivě nízké překrývání izotopických obálek u velkých mol. hmotností lze připsat omezení počtu rozštěpených kanálů a nižší hustotě náboje u vysokých m/z prekurzorů.
• Autoři uvádějí, že lqCID lze aplikovat i na delší oligonukleotidy (>100 nt), na jednovláknovou DNA a na modifikované RNA, přičemž výsledky ukazují slib pro rozšíření velikostního rozsahu použitelnosti MS pro sekvenování oligonukleotidů.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné snížení spektrální složitosti vede k jednoduššímu a jistějšímu přiřazování sekvenčních iontů, což urychluje analýzu a snižuje potřebu manuální validace.
• Kompatibilita s NETD/EPD a možnost použití v MS3 rozšiřuje schopnost charakterizovat nabité radikálové intermediáty a zvyšuje sekvenční pokrytí.
• Možnost analyzovat větší oligonukleotidy (50 mer až ~100 mer a více) otevírá cestu k aplikacím v farmaceutickém vývoji, kontrole kvality oligonukleotidových léčiv a výzkumu RNA struktury a modifikací.
• Užitečné pro analýzu modifikovaných nukleotidů, kde je vysoká selektivita prvotních štěpení klíčová pro lokalizaci modifikace bez záměny se sekundárními produkty.

Omezení a provozní poznámky

• lqCID vyžaduje pečlivou optimalizaci q a NCE pro konkrétní m/z a stav nabití prekurzorů; nevhodné nastavení může vést k nedostatečnému rozštěpení nebo naopak k přechodu k nežádoucím druhotným štěpením.
• V některých sekvenčních motivech zůstávají izobarické fragmenty problémem nezávisle na metodě aktivace; tedy doplňkové informační kroky (MSn, komplementární aktivace) mohou být stále potřeba pro jednoznačné přiřazení.
• Pro plné využití (NET-lqCID) je potřeba infrastruktura pro NETD/EPD (reaktantní ionty, UV laser nebo modifikace přístroje), což může vyžadovat experimentální úpravy přístrojů nebo dodatečné vybavení.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace lqCID do standardních pracovních postupů pro analýzu oligonukleotidů v průmyslových a klinických laboratořích, zejména tam, kde je důležitá vysoká jistota sekvenčního přiřazení.
• Další rozvoj kombinovaných workflow (NETD/EPD + lqCID) pro cílené mapování modifikací a pro analýzu komplexních směsí oligonukleotidů.
• Rozšíření aplikace pro velmi dlouhé oligonukleotidy (≥100 mer) a pro robustní analýzu terapeutických oligomerů, včetně chemicky modifikovaných aptamerů, siRNA a mRNA fragmentů.
• Automatizace optimalizace parametrů (q, NCE, doba aktivace) pomocí softwarových nástrojů pro automatické nastavení podmínek podle m/z a stavu nabití prekurzoru, což zrychlí rutinní aplikace metody.

Závěr

Snížení Mathieu q v ion-trap CID (lqCID, q ≈ 0.15) představuje účinný způsob, jak omezit maximální kinetickou energii aktivujících srážek a tím potlačit vznik interních fragmentů a ztrát bází. Výsledkem jsou jednodušší, sekvenčně informativní spektra s převahou primárních c/y nebo d/w iontů, což výrazně zvyšuje spolehlivost přiřazení a umožňuje analýzu delších a modifikovaných oligonukleotidů. lqCID je kompatibilní se strategií NETD/EPD a má potenciál stát se standardní součástí analytických workflow pro oligonukleotidovou charakterizaci.

Reference

1. Huang T. et al. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 2008;19:1832–1840.
2. Gao Y., McLuckey S.A. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2013:249–257.
3. Taucher M., Breuker K. Angewandte Chemie. 2012;124(45):11451–11454.
4. Peters-Clarke T.M. et al. Analytical Chemistry. 2020;92(6):4436–4444.
5. Gabelica V. et al. Analytical Chemistry. 2006;78(18):6564–6572.
6. Yip P. et al. Methods for Data Dependent Mass Spectrometry of Mixed Protein Analysis. US Patent US 10,217,619 B2, 2019.