Ion-Pair Reversed-Phase LC/MS Analysis of GalNAc-siRNA Conjugates under Denaturing and Non-Denaturing Conditions

Analýza GalNAc-siRNA konjugátů iontově párovou reverzní fází LC/MS za denaturačních a nondenaturačních podmínek

Význam tématu

Oligonukleotidové terapie, zejména siRNA upravené konjugací s N-acetylgalaktosaminou (GalNAc), představují důležitou třídu účinných lékových nosičů pro cílení na játra. Spolehlivá analýza integrity, stavů duplexu a potvrzení molekulové hmotnosti GalNAc-siRNA je klíčová pro vývoj, kontrolu jakosti a regulaci těchto biologicky aktivních látek. Metody LC/MS umožňují oddělení, identifikaci a kvantifikaci oligonukleotidů i jejich konjugátů v různých konformačních stavech, což usnadňuje rozhodnutí o stabilitě a správnosti syntézy.
Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo ukázat použití iontově párové reverzní-fázové LC/MS pro analýzu GalNAc-siRNA konjugátů za denaturačních (vysoká teplota kolony) a nondenaturačních (nízká teplota) podmínek. Studie demonstrovala schopnost jediného kvadrupólu potvrdit molekulovou hmotnost, odlišit duplexní a jednovláknové formy chromatograficky a využít softwaru LabSolutions Insight Biologics pro automatizovanou identifikaci sekvencí s modifikacemi.
Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografie: UHPLC Nexera XS inert se stacionární fází Shim-pack Scepter Claris C18-300 (100 × 2.1 mm, 1.9 µm).
• Mobilní fáze: A = 100 mM HFIP + 10 mM TEA ve vodě; B = methanol. Gradient: B 10 % (0 min) → 50 % (10 min) → 90 % (10.1–12 min) → 10 % (12.1–20 min).
• Průtok: 0.3 mL/min; objem injekce: 1 µL; teplota kolony: experimentálně 25 °C nebo 60 °C.
• Hmotnostní spektrometrie: LCMS-2050 single quadrupole se zahřívaným DUIS iontovým zdrojem (kombinace ESI/APCI). Režim: negativní ionizace; m/z rozsah 550–2000. Parametry plynu a teplot: nebulizace 2.0 L/min, drying gas 5.0 L/min, heating gas 7.0 L/min, desolvation 450 °C, DL 200 °C.
• Software: LabSolutions Insight Biologics pro konfiguraci oligonukleotidových sekvencí (nukleobáze, linkery, ribózy, modifikace včetně Tri‑GalNAc), automatizovanou dekonvoluci a přiřazení komponent na základě MS1.
• Vzorek: duplexní siRNA odvozené od sekvence Givosiranu, obsahující 2'-modifikace (2'-O‑methoxy, 2'‑deoxy‑2'‑fluoro), fosforotioátové vazby a 3'-konjugaci Tri‑GalNAc na smyslovém vláknu.

Hlavní výsledky a diskuse

• Při 25 °C se GalNAc-siRNA eluuje převážně jako jeden hlavní vrchol odpovídající duplexní, nedenarurované formě; v UV chromatogramu dominuje jednotný signál.
• Při zvýšení teploty kolony na 60 °C dochází k denaturaci duplexu a chromatograficky se objeví dva oddělené vrcholy, které odpovídají uvolněným jednovláknovým sense a antisense řetězcům.
• LabSolutions Insight Biologics úspěšně přiřadil jednotlivé sekvence k komponentám na základě MS1 spekter. Identifikace byla realizována s chybou hmotnosti menší než 1 Da vůči teoretické molekulové hmotnosti pro oba řetězce při obou teplotách.
• Single kvadrupól potvrdil svou užitečnost pro rychlé ověření molekulové hmotnosti a kontrolu kvality, i když nepodporuje MS/MS pro sekvenační analýzu; pro podrobnější sekvenační informace jsou vhodnější Q-TOF či jiné MS/MS platformy.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost rozlišit konformační stav (duplex vs. jednovláknový) jednoduchou změnou teploty kolony bez zásahu do mobilních fází nebo složitých příprav vzorku.
• Rychlá a robustní kontrola molekulové hmotnosti GalNAc-siRNA konjugátů vhodná pro vývoj a QA/QC v biotechnologickém a farmaceutickém prostředí.
• Softwarová podpora pro zadávání modifikovaných sekvencí a automatické přiřazení usnadňuje analýzu více sekvencí současně a zrychluje rutinní pracovní postupy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metodiky o vysokorozlišovací MS a MS/MS (např. Q-TOF) pro detailní mapování modifikací a potvrzení pořadí nukleotidů.
• Vývoj nativních metod LC/MS pro sledování komplexních konformací a interakcí oligonukleotidů s bílkovinami nebo jinými ligandy.
• Automatizace a integrace softwaru pro hromadné zpracování sekvencí, validaci výsledků a reportování podle farmaceutických standardů.
• Implementace v rutinním QC pro klinické kandidáty a výrobní kontroly, včetně sledování degradace a produktů post‑syntetické modifikace.

Závěr

Iontově párová RP‑LC/MS metodika s použitím LCMS‑2050 single kvadrupólu a softwaru LabSolutions Insight Biologics poskytuje efektivní nástroj pro potvrzení molekulové hmotnosti a rozlišení konformačních stavů GalNAc‑siRNA konjugátů. Změna teploty kolony umožňuje chromatografické oddělení duplexní a denaturované formy, přičemž identifikace sekvencí proběhla s vysokou přesností v rámci ±1 Da. Pro detailní sekvenační rozbory je však vhodné využít MS/MS platformy.
Reference

1. Acknowledgments: Tento výzkum byl podpořen AMED granty JP21ae0121022, JP21ae0121023 a JP21ae0121024 (projektový vedoucí Satoshi Obika).
2. Related Applications: Characterization of GalNAc‑siRNA Conjugates Using a Quadrupole Time‑of‑Flight Mass Spectrometer (Application News No. 01‑01176‑EN).
3. Related Applications: Reversed‑Phase Ion‑Pair LC/MS Analysis of siRNA under Denaturing and Non‑Denaturing Conditions (Application News No. 01‑00915‑EN).
4. Related Applications: Efficient Method Development for Separation of Capped mRNA Fragments (Application News No. 01‑00898‑EN).