Efficient Method Development through Design Space Evaluation on Different Brands of Columns

Efektivní vývoj metod pomocí vyhodnocení design space na různých značkách C18 kolon

Význam tématu

V rychle se rozvíjející oblasti chromatografie má volba kolony a optimalizace pohyblivé fáze zásadní vliv na separaci analytů. Systematické, vizuální hodnocení tzv. design space umožňuje efektivní screening kolón a parametrů bez nutnosti rozsáhlých empirických testů, což šetří čas, materiál a zvyšuje reprodukovatelnost výsledků. Implementace přístupu Analytical Quality by Design (AQbD) do metody vývoje vede k robustnějším a lépe zdokumentovaným analytickým postupům.

Cíle a přehled studie / článku

Studie porovnává selektivitu šesti značek C18 kolón při isokratické separaci tří modelových sloučenin (amitriptylin – zásaditý, kyselina benzoová – kyselá, fenol – neutrální). Cílem bylo vizualizovat design space (minimální rozlišení mezi třemi sloupci) a identifikovat kolonu s nejširší oblastí provozních podmínek splňujících nastavená kritéria rozlišení. Součástí bylo i zobrazení chromatogramů a porovnání tvaru píků (symetrie).

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Režim: isokratická separace
• Mobilní fáze: A = 0,1 % kyselina mravenčí ve vodě; B = směs acetonitril/metanol v poměrech ACN:MeOH = 30:70, 50:50, 70:30 (3 hladiny)
• Počáteční koncentrace organické fáze: 40 %, 45 %, 50 % (3 hladiny) – dohromady 3×3 = 9 měření pro každý typ kolony
• Teplota kolony: 40 °C; průtok: 0,5 mL·min−1; injekční objem: 1 µL (80 mg·L−1); detekce: 254 nm (SPD‑M40, UHPLC celka)
• Cílové analytické kritérium: vyhodnocování minimálního rozlišení mezi trojicí analytů; další kritéria zahrnuta při překrytí design space (např. min. rozlišení ≥ 6, rozlišení amitriptylinu ≥ 18)

Instrumentace:

• System: Nexera X3 (Method Scouting System)
• Software pro vývoj metody: LabSolutions MD (podpora konceptu design space a AQbD; matrix view, overlay design spaces)
• Testované kolony: 6 značek C18 (včetně Shim-pack Arata C18). Uvedené rozměry: 100 mm × 3.0 mm I.D. s různými velikostmi částic (1.8–3 μm v různých sloupcích)

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčové poznatky:

• Design space: Pro každý typ kolony byl vytvořen mapovaný design space minimálního rozlišení jako funkce počátečního obsahu organiky a poměru acetonitrilu v organické fázi. Červené oblasti označují vysoké rozlišení, modré nízké.
• Výkon Shim-pack Arata C18: Tato kolona vykázala největší plochu s vysokým rozlišením a v zobrazeném design space prakticky chyběly oblasti s nízkým rozlišením. To ukazuje odlišnou, příznivou selektivitu vůči ostatním C18 kolonám.
• Tvar píků a interakce se silanolovými skupinami: Chromatogramy ukázaly, že Shim-pack Arata poskytuje výrazně lepší tvar píků pro amitriptylin (symetrický faktor ~1.05) než ostatní kolony (symetrické faktory 2.11–4.31), které trpěly širšími a asymetrickými pík y pravděpodobně kvůli interakcím se silanolovými povrchy plnící náplně.
• Stabilita rozlišení při zrychlení metody: Při zvýšení podílu acetonitrilu (rychlejší eluce) si Arata kolona udržela dostatečné rozlišení mezi kyselými, zásaditými a neutrálními látkami, zatímco u ostatních kolón došlo k výraznému zhoršení rozlišení B a C.
• Overlay design spaces: Překrytím oblastí plnících více kritérií (např. min. rozlišení ≥ 6 a rozlišení amitriptylinu ≥ 18) bylo možné rychle identifikovat provozní oblast splňující oba cíle; u Arata kolony byla tato oblast nejrozsáhlejší.

Interpretace:

Výsledky ukazují, že i mezi C18 kolónami existují významné rozdíly v selektivitě a interakcích s analyty. Vizualizace design space poskytuje přehled o tom, jak technologické vlastnosti náplně (např. úpravy povrchu omezující silanolové interakce) ovlivňují separaci napříč rozsahem provozních parametrů. To usnadňuje rozhodování o kompromisu mezi rychlostí analýzy a kvalitou separace.

Přínosy a praktické využití metody

• Snížení počtu experimentů: Systematický 3×3 screening v kombinaci s vizualizací design space umožňuje identifikovat vhodné kolony a podmínky bez nutnosti rozsáhlých empirických testů.
• Rychlé porovnání kolón: Matrix view v LabSolutions MD vizuálně porovnává velké množství chromatogramů najednou, což zrychluje selekci optimální kolony.
• Robustnost a reprodukovatelnost: AQbD přístup vede k metodám lépe zdokumentovaným vůči změnám provozních parametrů (robustnost), což je klíčové pro kvalitu a validaci metod v QA/QC prostředí.
• Praktické nasazení: Metoda je vhodná pro počáteční fáze vývoje analytických procedur, screening kolón v kontrolních laboratořích, farmaceutickém vývoji a rutinním nastavení metod.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření parametrického prostoru: Začlenění dalších proměnných (pH, typ pufru, gradientní programy, teplotní rozsahy) by vedlo k komplexnějším a robustnějším design space.
• Víceúčelné testovací sady analytů: Testování širšího spektra chemických tříd a většího počtu analy­tů odhalí nuance selektivity kolón v reálnějších analytických aplikacích.
• Automatizace a strojové učení: Integrace algoritmů pro návrh experimentů (DoE) a modelování by mohla dále zrychlit výběr podmínek a predikovat výkon kolony mimo testované body.
• Standardizace a sdílení dat: Vytváření knihoven design space pro různé kolony a aplikace usnadní sdílení znalostí mezi laboratořemi a zrychlí adopci AQbD přístupu.
• Rozšíření na jiné materiály kolón: Aplikace stejného přístupu na kolony s alternativními stacionárními fázemi (polar‑embedded, phenyl, HILIC) pro širší škálu separací.

Závěr

Prezentovaná aplikace ukazuje, že použití LabSolutions MD a vizualizace design space je efektivní strategie pro rychlý a informovaný výběr C18 kolony a optimalizaci isokratických podmínek. Shim-pack Arata C18 vystoupila jako kolona s odlišnou a výhodnou selektivitou – lepšími tvary píků a širšími provozními oblastmi s přijatelným rozlišením i při zrychlení analýzy. Tento přístup snižuje potřebu empirických pokusů a podporuje AQbD principy v analytickém vývoji.

Reference

1. Shimadzu Application News: Software for Efficient Method Development – Design Space Evaluation on Different Brands of Columns. Shimadzu Corporation, First Edition Apr. 2026.
2. Uznání: Dr. Naoki Asakawa (formerly Eisai Co., Ltd.) – přínos k diskusi uveden v originálním materiálu.