Authenticity Evaluation of Insect Protein-Containing Food Products

Autentizace potravin obsahujících hmyzí protein pomocí LC/MS — shrnutí aplikované studie

Význam tématu

Rostoucí zájem o hmyzí bílkoviny jako udržitelnou alternativu živočišných proteinů vyvolává potřebu spolehlivé autentizace surovin a ověření deklarovaného složení potravin. Přesná taxonomická identifikace zdroje bílkovin je důležitá pro dodržování označování, kontrolu nežádoucích alergenů a plnění regulatorních požadavků. Metody založené na LC/MS dokážou detekovat specifické peptidové markery i v komplexních a tepelně upravených matricích, což je klíčové pro kontrolu kvality a bezpečnosti nových potravinářských výrobků.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje pracovní postup založený na LC/MS pro taxonomickou autentizaci složek odvozených z hmyzu v komerčních proteinových tyčinkách obsahujících mouku z domácí kobylky (Acheta domesticus). Hlavní cíle byly: ověřit přítomnost hmyzího materiálu na úrovni druhu, potvrdit deklarované rostlinné a živočišné ingredience a vyhodnotit specifické peptidové markery vhodné pro sledování shody označení a potenciální monitoring alergenů.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika (souhrn):

• Vzorky: několik komerčních proteinových tyčinek označených jako obsahující mouku z Acheta domesticus (C-BAR01–C-BAR05) a jeden negativní kontrolní vzorek bez hmyzu (N-BAR).
• Předúprava: kryogenní mletí v tekutém dusíku, trojnásobná delipidace hexanem (sonikace + centrifugace) pro odstranění lipidů, které by snižovaly extrakci a analýzu.
• Extrahování proteinů: pufr 7 M urea, 2 M thiourea, 50 mM DTT, 100 mM Tris-HCl pH 8; sonikace, centrifugace, kvantifikace Bradfordovým testem (BSA kalibrace), práce v trojích replikátech.
• Redukce/alkylace a štěpení: redukce 10 mM DTT (60 °C, 30 min), alkylace 30 mM IAA (37 °C, 1 h), následné ředění a přes noc trypsinová digestace (enzym : substrát 1:50, 37 °C). Digesty očištěny SPE, vysušeny a rekonstituovány v 2 % acetonitrilu/0,1 % FA.
• LC/MS: reverzní fázová separace peptidů na sloupci Agilent AdvanceBio Peptide Mapping C18 (2.1 × 150 mm, 2.7 µm) při 60 °C, mobilní fáze 0,1 % FA ve vodě (A) a v acetonitrilu (B), průtok 0.3 mL/min, injektováno 40 µL (cca 250 µg peptidového materiálu), gradient ~90 min.
• MS akvizice: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF v pozitivním ESI módu, data‑dependent acquisition (DDA) pro MS/MS, rozmezí m/z 300–3200 (MS) a 50–3200 (MS/MS), rychlost 2 spektra/s (MS) a 8 spekter/s (MS/MS), izolace m/z 4, aktivní vyloučení po 2 spektrách apod.
• Identifikace: databázové vyhledávání proti UniProtKB (celková referenční proteomika), A. domesticus proteomu a databázi kontaminantů; parametry: trypsin, až 2 missed cleavages, precursor tolerance 20 ppm, fragment tolerance 0.05 Da, fixní karbamidomethylace Cys, oxidace Met jako variabilní.
• Taxonomické mapování: použití Unipept pro určení unikátních peptidů specifických pro taxony (od druhu po kmen), a označení nespecifických peptidů sdílených mezi taxa.

Použitá instrumentace:

• Agilent 1290 Infinity III Bio LC (High‑Speed Pump G7132A, Multisampler G7137A, Multicolumn Thermostat G7116B s Quick Connect Bio Heat Exchanger).
• Kolona: Agilent AdvanceBio Peptide Mapping C18, 2.1 × 150 mm, 2.7 µm.
• Detektor: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s Dual Jet Stream ESI zdrojem.
• Další činidla a spotřební materiál: hexan, acetonitril, formic acid, urea, thiourea, DTT, IAA, sequencing‑grade trypsin, Bradford kit atd.

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky analýzy:

• Průměrně bylo získáno ~78 683 MS/MS spekter na vzorek (n = 3), z nichž bylo v průměru ~8 753 přihlášeno jako shody peptidů, což odpovídá identifikačnímu procentu ~11,1 %. Toto pořadí je typické pro vysoce komplexní potravinářské matrice.
• Taxonomické mapování pomocí Unipept ukázalo přítomnost očekávaných rostlinných a mléčných složek (např. Glycine max – sója, Prunus dulcis – mandlovník, Arachis hypogaea – arašídy, Fagopyrum esculentum – pohanka, Oryza sativa – rýže, Avena sativa – oves, Cocos nucifera – kokos), což podporuje shodu s deklarovanými ingrediencemi.
• Ve vzorcích označených jako obsahující kobylčí mouku (C‑BAR01–C‑BAR05) bylo detekováno 25–41 peptidů zařazených do kmene Arthropoda, z toho 10–12 peptidů mapovaných na podčeled Gryllinae. Negativní kontrola (N‑BAR) neobsahovala peptidy přiřaditelné k hmyzu.
• Bylo identifikováno pět peptidů jednoznačně specifických pro Acheta domesticus; pocházely ze tří proteinů: Apolipophorin‑III a dva tropomyosiny (Tropomyosin 1 a 2). Konkrétně byly jako zvlášť relevantní vyzdviženy peptidy LQEASEAADEAQKR a ALQTAEGEIAALNR.
• Souběžně pozorovaná intenzita (EIC plocha) těchto peptidů korelovala s deklarovaným procentuálním podílem kobylčí mouky mezi různými tyčinkami, což naznačuje možnost semi‑kvantitativního uplatnění metody.

Diskuse a omezení:

• Detekce druhově specifických peptidů v procesu DDA v komplexních potravinových matricích dokazuje robustnost přístupu, nicméně identifikační pokrytí není kompletní (~11 %), což je dáno vysokou složitostí vzorků, řadou ingrediencí a proteolytickou variabilitou.
• Ne všechny peptidy se vyskytly ve všech vzorcích; ověřitelnost markerů závisí na zpracování, množství hmyzího materiálu a matrice. Proto pro routiní kontrolu může být vhodné převést poznatky do cílených metod (MRM/PRM) pro větší citlivost a kvantifikaci.
• Přesnost taxonomické přiřaditelnosti závisí na dostupnosti a kvalitě referenčních proteomických databází; pro méně dobře pokryté druhy může být nutné rozšířit lokální databáze.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické přínosy:

• Schopnost potvrdit přítomnost konkrétního druhu hmyzu (A. domesticus) v komerčních produktech, což podporuje kontrolu označování a regulaci nových potravinářských surovin.
• Identifikace rostlinných i živočišných složek v komplexních matricích umožňuje širší kontrolu souladu složení se štítkem.
• Peptidové markery z Apolipophorin‑III a tropomyosinů mohou sloužit zároveň pro sledování potenciálních alergenů; tropomyosiny jsou známé pan‑alergeny s rizikem zkřížené reaktivity se škeblovitými mořskými plody.
• Možnost semi‑kvantitativního vyhodnocení na základě EIC ploch pro odhad relativního podílu hmyzího materiálu mezi výrobky.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možnosti a doporučení pro další rozvoj:

• Přechod od DDA k cíleným LC‑MS metodám (MRM/PRM) umožní zvýšit citlivost, specifitu a kvantitativní schopnosti pro rutinní kontroly a monitorování alergenů.
• Rozšíření referenčních databází proteomů jedlého hmyzu a dalších potravinových druhů zlepší spolehlivost taxonomických přiřazení.
• Integrace výsledků LC/MS s molekulárně‑genetickými metodami (DNA‑barcoding) by poskytla komplementární potvrzení původu surovin, zejména u vysoce zpracovaných vzorků.
• Standardizace pracovních postupů (včetně předúpravy, delipidace a digestních protokolů) podpoří reprodukovatelnost mezi laboratořemi a vytvoří podklad pro regulační metodiky.

Závěr

Popsaný LC/MS workflow s použitím Agilent 1290 Infinity III Bio LC a Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q‑TOF prokázal schopnost identifikovat druhově specifické peptidové markery Acheta domesticus v komerčních proteinových tyčinkách. Konzistentní detekce pěti druhově specifických peptidů z apolipophorinu a tropomyosinů potvrdila přítomnost kobylčího materiálu v deklarovaných výrobcích a jejich absenci v negativní kontrole. Metoda je vhodná pro ověřování pravosti surovin, podporu shody označení a pro potřeby sledování alergenů, přičemž další optimalizace (cílené metody, rozšířené databáze) by zvýšila její rutinní použitelnost.

Reference

1. Giampieri F.; Álvarez Suárez J. M.; Machì M.; Cianciosi D.; Navarro Hortal M. D.; Battino M. Edible insects: A Novel Nutritious, Functional, and Safe Food Alternative. Food Front. 2022, 3(3), 358–365.
2. Pilco Romero G.; Chisaguano Tonato A. M.; Herrera Fontana M. E.; Chimbo Gándara L. F.; Sharifi Rad M.; Giampieri F.; Battino M.; Vernaza M. G.; Álvarez Suárez J. M. House Cricket (Acheta domesticus): a Review Based on Its Nutritional Composition, Quality, and Potential Uses in the Food Industry. Trends Food Sci. Technol. 2023, 142, 104226.
3. Siddiqui S. A.; Zhao T.; Fitriani A.; Rahmadhia S. N.; Alirezalu K.; Fernando I. Acheta domesticus (House Cricket) as Human Foods—an Approval of the European Commission—A Systematic Review. Food Front. 2024, 5(2), 435–473.
4. Farkas V. I.; Máté M.; Takács K.; Jánosi A. The House Cricket (Acheta domesticus Linnaeus) in Food Industry: Farming, Technological Challenges, and Sustainability Considerations. Appl. Sci. 2025, 15(17), 9494.
5. Mesuere B.; Debyser G.; Aerts M.; Devreese B.; Vandamme P.; Dawyndt P. The Unipept Metaproteomics Analysis Pipeline. Proteomics 2015, 15(8), 1437–1442.
6. Hashiguchi T.; Hashiguchi M.; Tanaka H.; Gondo T.; Akashi R. Comparative Analysis of Seed Proteome of Glycine max and Glycine soja. Crop Sci. 2020, 60(3), 1530–1540.
7. De Marchi L.; Wangorsch A.; Zoccatelli G. Allergens from Edible Insects: Cross Reactivity and Effects of Processing. Curr. Allergy Asthma Rep. 2021, 21(5), 35.
8. Lopata A. L.; Kleine Tebbe J.; Kamath S. D. Allergens and Molecular Diagnostics of Shellfish Allergy. Allergo J. Int. 2016, 25, 210–218.
9. Palmer L. K.; Marsh J. T.; Lu M.; Goodman R. E.; Zeece M. G.; Johnson P. E. Shellfish tropomyosin IgE Cross Reactivity Differs Among Edible Insect Species. Mol. Nutr. Food Res. 2020, 64, e1900923.
10. Karnaneedi S.; Johnston E. B.; Bose U.; Juhász A.; Broadbent J. A.; Ruethers T.; Jerry E. M.; Kamath S. D.; Limviphuvadh V.; Stockwell S.; et al. The Allergen Profile of Two Edible Insect Species—Acheta domesticus and Hermetia illucens. Mol. Nutr. Food Res. 2024, 68, 2300811.
11. Barre A.; Pichereaux C.; Simplicien M.; Burlet Schiltz O.; Benoist H.; Rougé P. A Proteomic and Bioinformatic Based Identification of Specific Allergens from Edible Insects: Probes for Future Detection as Food Ingredients. Foods 2021, 10(2), 280.