Behind the bench: Tips to simultaneously analyze THC, its metabolites, and other drugs of abuse using LC-MS

Význam tématu

Analýza THC a jeho metabolitů v rámci toxikologických panelů má vysoký praktický význam pro forenzní laboratoře, dopravní bezpečnost a pracovní screening. Po alkoholu je konzumace konopí nejčastěji detekovanou drogou při řízení pod vlivem; přesné, citlivé a současné stanovení THC spolu s ostatními látkami šetří čas, náklady a snižuje potřebu vícenásobných extrakcí a analýz.

Cíle a přehled studie / článku

Článek popisuje postupy a doporučení pro současné zařazení THC a jeho hlavních metabolitů do LC-MS/MS toxikologických metod určených pro biologické matice, zejména pro ústní tekutinu (oral fluid), krev a moč. Hlavním cílem bylo optimalizovat extrakci a chromatografii tak, aby byla zajištěna vysoká návratnost, rozlišení izomerů a citlivost v rámci širšího panelu drog (až 31 sloučenin podle technické poznámky).

Použitá metodika a instrumentace

Článek popisuje kombinaci dispersivní pevné fáze (DPX XTR™ INTip™) s mixed-mode SCX/WAX sorbenty pro extrakci z ústní tekutiny, následovanou UHPLC separací a hmotnostní spektrometrií. Klíčové prvky instrumentace a spotřebního materiálu uvedené v textu:

• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Horizon
• Hmotnostní spektrometr: Thermo Scientific Stellar™ a Orbitrap Exploris™ 120 (pro separaci izomerů)
• Kolony: doporučení Biphenyl (Accucore Biphenyl) a PFP / FluoroPhenyl (Raptor FluoroPhenyl 2.7 µm 100 × 2.1 mm) podle aplikace
• Sorbenty/extrakční tipy: DPX XTR INTip s mixed-mode SCX/WAX
• Spotřební materiál: silanizované skleněné zkumavky a vložky (minimalizace adsorpce); Venoject™ zelené trubice pro dlouhodobé skladování
• Sběrové pufry: Quantisal™ doporučen pro stabilizaci THC v ústní tekutině

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčová zjištění a doporučení shrnutá v článku:

• Metabolismus a matice: THC je oxidováno na psychoaktivní 11‑OH‑THC a dále na neaktivní THC‑COOH, který se může konjugovat s glukuronidem. THC a 11‑OH‑THC indikují nedávné užití (krev, ústní tekutina); THC‑COOH a jeho glukuronid jsou primárními cíli v moči pro delší detekční okno.
• Cutoffy: doporučené prahové koncentrace závisejí na standardech (SAMHSA, ANSI/ASB, National Safety Council); typické řády jsou v rozmezí jednotek ng/mL v krvi a ústní tekutině (např. ~1–10 ng/mL) a kolem 10 ng/mL v moči pro potvrzovací analýzu.
• Extrakce: silná lipofilita THC způsobuje nenásilnou adsorpci na plastové a nemalé povrchy; za účinné se ukázalo zachování methanolu (MeOH) ve všech krocích extrakce. Doporučené postupy zahrnují přidání MeOH do vzorku a IS tak, aby finální koncentrace MeOH v načteném vzorku byla ~20 % pro ústní tekutinu a použití 30 % MeOH jako mycí fáze u SPE pro zlepšení vazby THC na sorbent.
• Spotřební materiál: použití silanizovaných skleněných nádob a vložek významně redukuje ztráty adsorpcí.
• Chromatografie: C18 může vyžadovat vysoký podíl organiky pro elucci THC, což může snižovat citlivost; biphenylové a PFP fáze často poskytují lepší eluční profily a selektivitu; PFP slouží zvláště dobře pro separaci Δ8/Δ9 izomerů THC‑COOH při použití vodné fáze s 0.1 % kyselinou mravenčí a methanolu s 0.1 % kyselinou mravenčí.
• Optimalizace signálu: kombinace opatření (zvýšení objemu MeOH‑ředěného IS ze 10 % na 20 % vzorku, zvýšení mytí SPE z 10 % na 30 % MeOH, přechod z C18 na biphenyl a přidání organické složky re‑konstitučního roztoku jako první) vedla ke zvýšení signálu THC až přibližně 7×.
• Stabilita: stabilita THC závisí na matrici, teplotě a typu nádoby. V plastových zkumavkách při teplotě místnosti není stabilní; v krvi skladované při −20 °C v alkalických/heparinizovaných trubicích může být stabilní 6–12 měsíců.
• Separace izomerů: Δ8‑THC‑COOH a Δ9‑THC‑COOH lze účinně rozdělit pomocí PFP/FluoroPhenyl kolony a vhodného gradientu; analýzy provedeny na Vanquish UHPLC a Orbitrap Exploris poskytly nezáměnné chromatografické oddělení.
• Obecné testy kvality: doporučeny jsou suché testy (dry down), testy postupného eluování (sequential elution) a mycí testy pro stanovení optimálního podílu organické fáze, aby se minimalizovaly ztráty a zajistila úplná eluace analyzovaných látek.
• Výkonnost metody: u ústní tekutiny bylo dosaženo návratnosti THC >70 % při zachování schopnosti metody splnit požadované cutoffy pro všech 31 analyzovaných drog.
• Buffer pro sběr: Quantisal významně (cca 150× vyšší plocha chromatografického signálu) zlepšil signál THC ve srovnání s jiným běžným sběrným pufrem.

Přínosy a praktické využití metody

Začlenění THC do širších LC‑MS toxikologických panelů umožňuje:

• úsporu času a nákladů díky jediné extrakci a analýze pro více tříd látek,
• zvýšení provozní efektivity forenzních laboratoří a dopravních laboratoří,
• lepší interpretaci výsledků v kontextu matice (rozlišení mezi recentním užitím a přetrvávajícím metabolitem v moči),
• zvýšení spolehlivosti díky speciálnímu výběru kolony, optimalizovaným extrakčním podmínkám a vhodným spotřebním materiálům.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry vývoje a aplikace:

• Další integrace multi‑analyzových panelů zahrnujících syntetické kanabinoidy a nové psychoaktivní látky s cílem pokrýt širší spektrum látek jedním běžícím protokolem.
• Využití vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie (HRMS) pro zvýšení selektivity, identifikaci nových metabolitů a neznámých izomerů.
• Standardizace postupů sběru a skladování (pufry, nádoby, teplota) pro minimalizaci degradace a zlepšení mezilaboratorní srovnatelnosti.
• Automatizace extrakce a validace protokolů pro rutinní forenzní provozy s důrazem na robustnost a reprodukovatelnost.

Závěr

Začlenění THC a jeho hlavních metabolitů do LC‑MS toxikologických panelů je praktické a ekonomicky výhodné. Klíčové pro úspěšnou implementaci jsou: správná volba extrakčních podmínek s přítomností MeOH, použití vhodných sorbentů a spotřebního materiálu minimalizujícího adsorpci, volba optimální chromatografické fáze (biphenyl/PFP) a provedení validačních testů (dry down, sequential elution, recovery). Při dodržení těchto zásad lze dosáhnout vysoké návratnosti, rozlišení izomerů a citlivosti potřebné pro forenzní aplikace.

Reference

1. National Transportation Safety Board. Alcohol, Other Drug, and Multiple Drug Use Among Drivers. 2022.
2. Center for Behavioral Health Statistics. Key Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2023 National Survey on Drug Use and Health. 2024.
3. Watanabe K., Yamaori S., Funahashi T., Kimura T., Yamamoto I. Cytochrome P450 enzymes involved in the metabolism of tetrahydrocannabinols and cannabinol by human hepatic microsomes. Life Sciences. 2007;80(15):1415–1419.
4. Huestis M.A. Pharmacokinetics and metabolism of the plant cannabinoids, Δ9‑tetrahydrocannabinol, cannabidiol and cannabinol. Handbook of Experimental Pharmacology. 2005;168:657–690.
5. Patterson C., Hassell K. Thermo Fisher Scientific Technical Note 003851. Quantitation of an oral fluid drug panel including THC using the new Stellar mass spectrometer.
6. Djilali E., Pappalardo L., Posadino A.M., Giordo R., Pintus G. Effects of the storage conditions on the stability of natural and synthetic cannabis in biological matrices for forensic toxicology analysis: An update from the literature. Metabolites. 2022;12(9):801.