Measuring Veterinary Drugs in Meat Using Matrix Calibration and Standard Additions

Měření veterinárních léčiv v mase pomocí kalibrace v matrici a standardních přídavků — automatizované workflow Easy Injector

Význam tématu

Analytika veterinárních léčiv v potravinářských matricích (např. maso) je kritická pro kontrolu bezpečnosti potravin a dodržování legislativních limitů. Složitá složení extraktů způsobují tzv. matrixové efekty, které mohou potlačit nebo naopak zvýšit signál analytů v LC‑MS/MS, a tím zkreslit kvantifikaci. Robustní a efektivní strategie kompenzace těchto efektů (kalibrace v matrici, standardní přídavky) jsou proto zásadní pro spolehlivá rozhodnutí v QA/QC a výzkumu.

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje použití Easy Injector workflow v softwaru Agilent MassHunter pro automatizované vytváření kalibrací a provádění standardních přídavků při měření 25 veterinárních léčiv v extraktu z masa. Srovnává tři přístupy: externí kalibraci v rozpouštědle, matrix‑matched kalibraci (diluce v blank matrici) a standardní přídavky přímo v injektoru. Cílem je ukázat, jak tyto přístupy ovlivňují přesnost a zotavení analytů, zvláště při nízkých koncentracích.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika

• Vzor: 2 g kominovaného vepřového masa; extrakce vícefázovým postupem s Na‑EDTA a acetonitrilem/s kyselinou formovou a DMSO.
• Čištění: Agilent Captiva EMR—Lipid (6 mL) pro odstraňování lipidů; kombinace gravitační eluace a sekundárního elučního kroku.
• Příprava kalibrací: Easy Injector automaticky vytvářel 1:4 ředící sérii z 500 ppb zásobního roztoku; body 125, 31.25, 7.81, 1.95, 0.488 ppb. Kalibrace byly provedeny v čistém rozpouštědle a pomocí blank matricové diluce. Pro standardní přídavky byly v injektoru připraveny spikované vzorky s navýšením o 1 a 10 ppb (z 10 a 100 ppb zásob).
• Injekční objem: 1 µL (0,9 µL při standardních přídavcích); mytí jehly 3 s v acetonitrilu.

Instrumentace (shrnutí)

• UHPLC: Agilent 1290 Infinity III (High‑Speed Pump G7120A, Multisampler G7167B, Multicolumn Thermostat G7116B)
• Kolona: Agilent InfinityLab Poroshell 120 Phenyl‑Hexyl, 2.1 × 150 mm, 1.9 µm; teplota 40 °C; průtok 0,5 mL/min; mobilní fáze A: 5 mM ammonium formiát + 0,1 % kys. formová ve vodě, B: obdobně v methanolu; gradient do 100 % B za 6,1 min; doba běhu 7 min + 3 min post time.
• MS: Agilent Ultivo triple quadrupole LC/MS s Agilent JetStream zdrojem; režim záznamu Dynamic MRM (pozitivní ionizace); capillary 3600 V; drying gas 8 L/min při 300 °C; sheath gas 10 L/min při 200 °C; nozzle 350 V. Q1/Q2 resolution unit (0.7 amu) optimalizováno autotunem.
• Software: Agilent MassHunter acquisition (v.12.2), Qualitative (v.12.0) a Quantitative (v.12.1) — Easy Injector modul integrovaný v rozhraní Multisampleru pro automatizaci ředění a spike procedur.

Hlavní výsledky a diskuse

Matrixové efekty

• Při kvantifikaci 10 ppb spikovaného vzorku pomocí kalibrace v čistém rozpouštědle byly pozorovány výrazné matrixové efekty: např. sulfanilamid vykázal potlačení signálu až na 20 % očekávané hodnoty. Některé jiné složky vykázaly až ~20% zvýšení signálu (ion‑enhancement) při kalibraci v rozpouštědle.
• Při použití matrix‑matched kalibrace se tyto odchylky významně korigovaly; typické zotavení pro 10 ppb vzorky bylo 95–105 %.

Standardní přídavky a nízké koncentrace

• Pro vzorky spikované na 1 ppb byla matrixová interference silnější. Kalibrace v rozpouštědle vedla k chybám (některé analytické signály nebyly detekovatelné nebo byly nadhodnocené), zatímco matrix‑matched kalibrace snížila vliv, např. u trimethoprimu, marbofloxacinu a ofloxacinu byly naměřené hodnoty blíže očekávaným (≈1.2 ppb místo ≈1.7 ppb při rozpouštědle).
• Automatizovaná standardní přídavková metoda připravená Easy Injectorem dosáhla u 1 ppb spikovaných vzorků typicky recovery mezi 90–110 %, čímž se potvrdila její schopnost zlepšit přesnost při hranicích kvantifikace.

Praktické poznatky o workflow

• Easy Injector zrychluje a automatizuje přípravu kalibračních řad i standardních přídavků přímo v sekvenci, čímž minimalizuje manuální kroky, riziko chyb a spotřebu času.
• Nastavení dilučního faktoru (1:4), umístění zásobních roztoků a automatické zápisy výsledků do MassHunter Quant umožňují plně integrovaný, opakovatelný proces kvantifikace.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje reprodukovatelný a automatizovaný přístup k kvantifikaci multiresiduálních souborů veterinárních léčiv v tukových matricích jako maso. Hlavní přínosy:

• Vyšší přesnost a spolehlivost kvantifikace díky použití matrix‑matched kalibrace nebo standardních přídavků pro potlačení matrixových efektů.
• Úspora času a snížení rizika lidské chyby díky Easy Injector automatizaci ředění a spike procedur.
• Vhodné pro rutinní kontrolu bezpečnosti potravin, metodické validace a případy, kdy standardní interní standardy nejsou dostupné pro všechny analyty.

Budoucí trendy a možnosti využití

Automatizace přípravy kalibrací a standardních přídavků bude nadále nabývat na významu se zvyšující potřebou vysokopropustných a spolehlivých laboratorních pracovních postupů. Očekávané směřování:

• Integrace vícezdrojové kontroly kvality (automatické kontrolní vzorky, interní standardy) do workflow Easy Injector pro další zvýšení robustnessy.
• Rozšíření automatizovaných ředicích a spike procedur na různé matrice (mléko, plodiny, ryby) a na širší spektrum analytů včetně termostabilních a silně vázaných látek.
• Využití pokročilých algoritmů zpracování dat v Quant softwaru pro automatickou detekci a korekci matrixových variací a pro lepší reporting při nižších LLOQ.

Závěr

Easy Injector integrovaný v Agilent MassHunter a 1290 Infinity III Multisampleru umožňuje plně automatizované vytváření kalibračních řad a provádění standardních přídavků, čímž zjednodušuje kvantitativní LC‑MS/MS analýzu vícekomponentních souborů veterinárních léčiv v masu. Matrix‑matched kalibrace a standardní přídavky účinně kompenzují matrixové efekty; matrix‑matched kalibrace dosáhla u 10 ppb recoveries ~95–105 %, zatímco automatizovaná standardní přídavková metoda zlepšila přesnost při 1 ppb s recovery 90–110 %. Metoda je vhodná pro rutinní kontroly i validace a přináší časové a kvalitativní výhody díky automatizaci.

Reference

1. Cakar, A. Easy and Fast Automation of Sample Preparation. Agilent Technologies application note, publication number 5994-7703EN, 2025.
2. Zhao, L.; Lucas, D. Multiclass Multiresidue Veterinary Drug Analysis in Beef Using Agilent Captiva EMR—Lipid Cartridge Cleanup and LC/MS/MS. Agilent Technologies application note, publication number 5991-8598EN, 2017.

Poznámka k doplňkovým datům

Appendix obsahoval MRM nastavení pro všech 25 sledovaných sloučenin (retenční časy, precursor/product iony, fragmentor, CE hodnoty). Tyto parametry byly optimalizovány autotunem a použity v režimu Dynamic MRM; konkrétní hodnoty jsou k dispozici v originálním materiálu pro implementaci metody v daném QqQ systému.