Conformation of Molecular Weight of Intact Proteins by Single Quadrupole Mass Spectrometer

Význam tématu

Biologické léčivé přípravky (biologika) jsou proteinové makromolekuly, jejichž správná molekulová hmotnost je klíčová pro kvalitu, bezpečnost a účinnost. Rychlé a spolehlivé potvrzení molekulové hmotnosti intaktních proteinů je v průmyslové praxi důležité zejména pro kontrolu syntézy a QA/QC. Ukázka použití jednoduchého single-quadrupolového LC–MS (LCMS-2050) spolu se softwarovou dekonvolucí demonstruje, že i méně komplexní přístroj může v rutinních aplikacích poskytnout dostačující informace o molekulové hmotnosti a přítomných variantách.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo ověřit, zda lze za použití LCMS-2050 (single quadrupole) v kombinaci se softwarem LabSolutions Insight Biologics potvrdit molekulovou hmotnost několika modelových proteinů. Studie předvádí analytické nastavení, ukazuje výsledky dekonvoluce mnohonásobně nabitých iontů a demonstruje přehledné vizuální zobrazení výsledků pro snadné posouzení přítomnosti hlavních komponent a nečistot.

Použitá metodika a instrumentace

Analytický přístup:

• Reverzní fázová LC separace s acetonitrilem a 0,1 % kyselinou mravenčí jako mobilními fázemi.
• Elektrospray/DUIS ionizace v pozitivním módu a akvizice m/z v rozsahu 500–2000 pro zachycení mnohonásobně nabitých iontů proteinů.
• Softwarová dekonvoluce mnohonásobných nábojových stavů pomocí LabSolutions Insight Biologics (algoritmus ReSpect) pro převod na nulový náboj a odhad molekulové hmotnosti.

Použitá instrumentace (shrnutí):

• Nexera X3 (HPLC) s analytickou kolonkou Shim-pack Scepter C4-300 (50 mm × 2.1 mm I.D., 3.0 µm).
• LCMS-2050 single quadrupole mass spectrometer (DUIS: ESI/APCI, positivní módu).

Klíčové provozní podmínky (stručně):

• Kolonka: C4, 40 °C, injekce 5 µL.
• Mobilní fáze: 0,1 % kyselina mravenčí ve vodě / 0,1 % kyselina mravenčí v acetonitrilu; průtok 0,4 mL/min; gradient 5 % B → 60 % B (5–15 min) → návrat 5 % B.
• MS: rozhraní 3.0 kV, scan m/z 500–2000; plyny: nebulizační 2 L/min, drying 5 L/min, heating 7 L/min; teploty: desolvatace 450 °C, DL 200 °C.

Vzorky

Analyzovány byly komerčně dostupné standardy rozpuštěné v ultrapure vodě: myoglobin (kůň), bovinní karbonanhydráza (červené krvinky) a β-kasein (mléko). Tyto modelové proteiny reprezentují různé molekulové hmotnosti a usnadňují demonstraci schopnosti dekonvoluce mnohonásobných nábojových stavů.

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky dekonvoluce a klíčové poznatky:

• Myoglobin: dekonvoluce vedla k odhadu molekulové hmotnosti přibližně 16949 Da (zobrazeno jako rekonstruovaný nulový náboj z [M+H]+). Mnohonásobné nábojové stavy byly dobře zachyceny v rozsahu m/z ~600–1400 a úspěšně dekonvolvány.
• Bovinní karbonanhydráza: výsledná rekonstruovaná hmotnost ~29020 Da; detekce velkého počtu nabitých stavů (Z ~19–44) potvrdila použitelnost rozsahu m/z použitého skenování pro větší proteiny.
• β-casein: softwarová analýza odhalila dvě chromatografické špičky s odhadovanými molekulovými hmotnostmi 24088 a 23979 Da, což naznačuje přítomnost dvou isoform nebo posttranslačních variant. Insight Biologics umožnil překrytí složkových chromatogramů a vizuální porovnání vypočtených hmotností s chromatografickými vrcholy.

Diskuse praktických aspektů:

• Single-quadrupole LC–MS prokázal schopnost potvrdit očekávané molekulové hmotnosti intaktních proteinů v případech, kdy jsou hlavní komponenty předpokládány.
• Vyšší přesnost a rozlišení by poskytly high-resolution MS přístroje; nicméně pro rutinní kontrolu a syntézu, kde nejsou nutné extrémně přesné hodnoty nebo identifikace drobných modifikací, je single quad ekonomicky a provozně výhodnou volbou.
• Klíčovým faktorem je kvalitní dekonvoluční software (ReSpect), který umožní převod mnohonásobně nabitých spekter na čitelné molekulové hmotnosti a vizuální interpretaci více komponent najednou.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé ověření molekulové hmotnosti intaktních proteinů v QA/QC laboratořích bez nutnosti vysokorozlišovací MS.
• Snížení nákladů a zjednodušení provozních postupů pro kontrolu produkce a syntézy biologik.
• Možnost detekce a vizuálního rozlišení variant/impurit (např. isoformy, addukty) při dostatečném chromatografickém rozlišení a vhodné dekonvoluci.
• Užitečné jako screeningový nástroj před hlubšími analýzami (top-down či high-resolution MS) v případě podezření na specifické modifikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Zlepšení softwarových algoritmů dekonvoluce a vizualizace umožní přesnější a rychlejší interpretaci spekter i z méně rozlišujících přístrojů.
• Integrace single-quadrupolových systémů do rutinních QC workflow s automatizovanou přípravou vzorků a reportováním výsledků pro zvýšení průchodnosti laboratoří.
• Vývoj hybridních, kompaktních instrumentů a zdokonalení ionizace pro zvýšení citlivosti a rozlišení v přenosných/nákladově efektivních řešeních.
• Rozšířené použití podobných přístupů i na další biologické makromolekuly, např. oligonukleotidy, se kterou souvisí další aplikační články výrobce.

Závěr

Demonstrace na třech modelových proteinech ukazuje, že single-quadrupolový LC–MS (LCMS-2050) v kombinaci s LabSolutions Insight Biologics poskytuje spolehlivou a přehlednou metodu pro potvrzení molekulové hmotnosti intaktních proteinů v rutinních aplikacích. Metoda je vhodná zejména pro kontrolu hlavních komponent a rychlé screeningové analýzy v průmyslovém prostředí; pro detailní charakterizaci drobných modifikací nebo extrémně přesné hmotnostní určení zůstávají preferovanými nástroji high-resolution MS systémy.

Reference

1. Kawashima M., Kato N., High-Performance Liquid Chromatograph Mass Spectrometer: Conformation of Molecular Weight of Intact Proteins by Single Quadrupole Mass Spectrometer, Shimadzu Application News, First Edition Jan. 2026.
2. Related Application News: Analysis of Oligonucleotide Impurities Using Single Quadrupole Mass Spectrometer, Application News No. 01-00974-EN.
3. Shimadzu Corporation, LCMS-2050 and LabSolutions Insight Biologics product documentation, 2026.