Quality Evaluation of mRNA by Electrophoresis

Význam tématu

mRNA technologie jsou základem moderních vakcín a léčiv, kde je klíčové zajistit vysokou čistotu a integritu transkriptovaných molekul. Rychlé a spolehlivé metody pro sledování degradace a odhalení vedlejších produktů během výroby umožňují zkrátit dobu vývoje, zvýšit kvalitu a zajistit bezpečnost konečného produktu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentované studie je ověřit schopnost mikro­čipové elektroforézy na systému Shimadzu MultiNA II MCE-301 pro hodnocení kvality mRNA. Pozornost je zaměřena na detekci degradačních fragmentů i příměsí cílových i necílových RNA za krátký čas analýzy (~100 s).

Použitá instrumentace

• Systém MultiNA II MCE-301 (Shimadzu) pro mikročipovou elektroforézu.
• MultiNA RNA Kit s interním standardem (markerový roztok) pro korekci mobility.
• RNA 6000 Ladder (Thermo Fisher Scientific) jako velikostní standard.
• Označovací barvivo SYBR Green II a separační pufr obsahující formamid.

Použitá metodika

Analýza byla prováděna na mRNA připravených z komerčních vzorků (CleanCap FLuc, Cas9 a Cre mRNA) s koncentracemi od 1 ng/µl do 100 ng/µl. Vzorky byly smíchány v poměru 1:1 s markerovým roztokem, zahřáty na 72 °C po dobu 3 min a rychle ochlazeny na led. Pro hodnocení stability FLuc mRNA byla použita termická denaturace při 90 °C v časech 0, 20, 40, 60, 120 a 180 min. Separace probíhala v lamelovém čipu s rychlostí analýzy přibližně 100 s na vzorek.

Hlavní výsledky a diskuse

mRNA degradační studie ukázala postupný úbytek hlavní špičky (FLuc mRNA, 1922 nt) a vznik špiček odpovídajících krátkým fragmentům s nárůstem plochy odpadu při delších expozicích teplu. Při hodnocení čistoty se i při míchání Cas9 mRNA (4522 nt) a Cre mRNA (1351 nt) v poměru až 100:1 podařilo detekovat slabou špičku Cre mRNA, což potvrzuje vysokou citlivost přístroje pro odhalení nízkých podílů nechtěných produktů.

Přínosy a praktické využití metody

• Velmi rychlá analýza (<100 s) vhodná pro online kontrolu procesů v syntéze mRNA.
• Vysoce automatizované měření s minimální manipulací a reprodukovatelné výsledky.
• Možnost kvantifikovat i nízké koncentrace degradovaných produktů či off-target RNA.

Budoucí trendy a možnosti využití

Samotná mikročipová elektroforéza může být dále rozvíjena v kombinaci s vysokokapacitními platformami pro paralelní screening. Integrace do kontinuálních výrobních linek a rozšíření o multiplexní značení umožní komplexní monitorování kvality různých druhů RNA a oligonukleotidů v reálném čase.

Závěr

Výsledky potvrzují, že systém MultiNA II MCE-301 představuje výkonnou a rychlou alternativu ke kapilární elektroforéze pro hodnocení integrity a čistoty mRNA. Díky automatizaci a krátkému času analýzy je přístroj ideální pro rutinní QC kontrolu ve výrobě RNA vakcín a terapeutik.