Identification of Double Bond Positions and Relative Acyl Chain Positions in Egg Yolk Phosphatidylcholines Using OAD-TOF System

Význam tématu

Phosphatidylcholiny (PC) představují zásadní třídu glycerolipidů, jejichž fyzikálně-chemické vlastnosti a biologická funkce jsou silně ovlivněny polohou acylových řetězců (sn-pozice) a lokalizací dvojných vazeb v mastných řetězcích. Rozlišení těchto izomerů je klíčové pro porozumění membránové permeabilitě, interakcím s proteiny, enzymovým specifitám a metabolickým odchylkám, např. v nádorových buňkách.

Cíle a přehled studie / článku

Úkolem prezentované aplikace je zavést rychlý a robustní LC-MS workflow založený na sekvenční kombinaci kolizní aktivací (CID) a oxygenní disociaci (OAD), označovaný jako OAciD. Metoda umožňuje v jediném analytickém běhu bez chemické derivatizace současné určení sn-pozic a poloh C=C vazeb v PC molekulách. Workflow demonstruje analýzu 24 molekulárních druhů PC v extraktu žloutku vajec, z nichž 8 je identifikováno až na úroveň C=C a 4 na obě úrovně.

Použitá metodika a instrumentace

Princip OAD: specificky napadá dvojnou vazbu kyslíkem a generuje charakteristické neutral losses pro lokalizaci C=C.
OAciD: sekvenční CID (vytvoří 1,3-dioxolanové fragmenty s preference sn-2) následované OAD na vzniklé produktové ionty pro selektivní identifikaci sn-1.
Vzorková příprava: extrakce 20 mg lecithinu z vaječného žloutku methanolem/isopropanolem (50:50), ultrazvuk 5 min, odstředění 15 000 g, 10 min.

Použitá instrumentace

• LCMS-9050 s OAD RADICAL SOURCE I (Prominence™+OAD-TOF system)
• Reverzní fáze, 45 °C, injekce 3 µL, gradientní eluce, průtok 0,3 mL/min
• Mobilní fáze A: 20 mM amonná sůl kyseliny mravenčí/voda; B: acetonitril/2-propanol (1:1, v/v)
• Ionizace ESI, pozitivní mód, DLC 250 °C, heat block 400 °C, interface 4,0 kV
• OAciD CE 30 V, TOF-MS rozsah m/z 150–1250, doba měření 38 min
• MS-DATA processing: MS-DIAL ver. 5.2.240424.3, režimy DDA-MS/MS, centroid data, tolerance MS1 0,01 Da, MS2 0,025 Da

Hlavní výsledky a diskuse

Identifikováno 24 PC molekulárních druhů: 12 kompletně lokalizováno na úrovni C=C automatickou analýzou OAD, 4 kompletně s určením sn-pozice i C=C. Detailní rozbor PC 16:0/18:1(n-9) ukázal v OAciD spektru signální iont m/z 393,2611 odpovídající sn-1 (C16:0) s nulovou odchylkou. Neutral loss 96,1298 Da potvrdil polohu dvojné vazby v C18:1(n-9). Další hlavní PC (např. PC 16:0/18:2, PC 18:1/18:1, PC 18:0/18:1) byly analogicky charakterizovány prostřednictvím diagnostických iontů uvedených v tabulce 4.

Přínosy a praktické využití metody

• Současné určení sn-pozice a polohy C=C v jediném OAciD běhu bez derivatizace.
• Plná kompatibilita s LC-separací a rychlé přepínání mezi režimy CID, OAD a OAciD (<1 min).
• Vysoká přesnost hmotnostního měření umožňuje spolehlivou anotaci struktur za pomoci MS-DIAL.
• Metoda vhodná pro profilování lipidů v biochemických, farmaceutických či QA/QC aplikacích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Zvýšení citlivosti pro stopové PC přidáním sodné soli do mobilní fáze.
• Rozšíření databáze diagnostických iontů v MS-DIAL pro plně automatizovanou anotaci.
• Aplikace OAciD na další třídy lipidů (triacylglyceroly, fosfatidylethanolaminy).
• Integrace do high-throughput lipidomických studií a biomarker discovery.

Závěr

Prezentovaný LC-OAciD-TOF workflow umožňuje poprvé spolehlivě určit jak sn-pozice, tak native polohy dvojných vazeb v PC z komplexních biologických vzorků v jediném měření. Metoda rozšiřuje analytické možnosti LC-MS lipidomiky a zvyšuje strukturální prokazatelnost lipidů.

Reference

1) Uchino H., Tsugawa H., Takahashi H., Arita M. Computational mass spectrometry accelerates C = C position-resolved untargeted lipidomics using oxygen attachment dissociation. Communications Chemistry. 5, 162 (2022).
2) Zhang W.P., Jian R.J., Zhao J., Liu Y.K., Xia Y. Deep-lipidotyping by mass spectrometry: recent technical advances and applications. Journal of Lipid Research. 63, 7 (2022).
3) Marshall D.L., Pham H.T., Bhujel M., Chin J.S.R., Yew J.Y., Mori K., Mitchell T.W., Blanksby S.J. Radical-mediated oxygen attachment dissociation mechanisms in lipid analysis. Analytical Chemistry. 88, 2685 (2016).