Charge variant analysis of cysteine-linked antibody-drug conjugates using an online multiple heart-cut 2D- SCX-SEC-LC HRAM MS approach

Význam tématu

Analýza variant náboje (charge variants) v konjugátech protilátka–lék (antibody-drug conjugates, ADC) je klíčová pro zajištění kvality, stability a bezpečnosti bioterapeutik. ADC, jako je polatuzumab vedotin, kombinuje precizní cílení monoklonální protilátky s cytotoxickou zátěží, což vyžaduje detailní charakterizaci heterogenity povrchového náboje vznikající po konjugaci a posttranslačních úpravách.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a optimalizovat online víceřezový dvourozměrný LC systém (2D-SCX-SEC-LC) spojený s vysokorozlišovací přesnou hmotnostní spektrometrií (HRAM MS) pro hloubkovou analýzu nábojové heterogenity cystein-vázaného ADC polatuzumabu vedotinu. Studie demonstruje separaci různých forem ADC podle poměru náboje (DAR) a dalších modifikací ovlivňujících izoelektrický bod.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda několikanásobného heart-cut 2D-LC:

• Řízená silná kationtová výměnná chromatografie (SCX) pomocí pH gradientu s použitím Thermo Scientific CX-1 bufferů (dimenze kolony ProPac 3R SCX 100×4 mm, 3 µm).
• Sběr až pěti frakcí (heart-cuts) o objemu 45–210 µL do 250 µL ložisek s aplikací zpětného průtoku (backflush) pro minimalizaci disperze
• Druhá dimenze: size exclusion chromatography (SEC) (MAbPac SEC-1, 300×4 mm, 5 µm) pro desalting a zachování nativních podmínek ADC
• Spectrometrie: Orbitrap Exploris 240 MS s BioPharma volbou pro vysokou citlivost, rozlišení a přesnost hmotnosti
• Softwarové nástroje: Thermo Chromeleon CDS pro řízení 2D-LC a BioPharma Finder pro dekonvoluci hrubých dat a identifikaci formálních masek

Hlavní výsledky a diskuse

• SCX rozložil 18 distinktích píků nábojových variant ADC, odpovídajících formám DAR0, DAR2, DAR4, DAR6 a DAR8 a dalším modifikacím (deamidace, oxidace, C-terminální odštěpení Lysinu).
• Zpětný průtok (backflush) při přenosu frakcí výrazně zužuje SEC píky a zvyšuje citlivost měření MS.
• Orbitrap Exploris 240 dokázal detekovat i nízkomnožné varianty (abundance < 0,5 %), např. komplexní mix DAR4, DAR6, DAR8 s +2 Lys v píků 18.
• BioPharma Finder umožnil přesnou dekonvoluci intactních spekter a přiřazení modifikací s ppm přesností.

Přínosy a praktické využití metody

• Integrovaný 2D-SCX-SEC-LC HRAM MS workflow zkracuje dobu analýzy a eliminuje potřebu off-line desaltingu.
• Široká aplikovatelnost pro různá ADC a monoklonální protilátky s odlišnými izoelektrickými body.
• Možnost sledovat nízkomnožné charge variants pro QA/QC v bioprodukci.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření dimenzí 2D separace o hydrophobic interaction chromatography (HIC) či ion mobility pro další úrovně rozlišení.
• Automatizace a high-throughput verze pro rutinní kontrolu kvality ve výrobních závodech ADC.
• Integrace s pokročilou datovou analýzou a strojovým učením pro predikci kritických kvalitativních parametrů.

Závěr

Online víceřezový 2D-LC systém kombinující SCX a SEC ve spojení s HRAM MS představuje robustní a vysoce citlivý přístup k charakterizaci nábojové heterogenity cystein-vázaných ADC. Metoda umožňuje detailní rozlišení DAR variant a posttranslačních modifikací pod nativními podmínkami, čímž přispívá ke zlepšení kontroly kvality a bezpečnosti bioterapeutik.

Reference

1. Lin S. et al, Thermo Fisher Scientific Application Note 20784. A novel pH gradient separation platform for mAb charge variant analysis.
2. Millán-Martín S. et al, Optimisation of the use of sliding window deconvolution for comprehensive characterisation of trastuzumab and adalimumab charge variants, Eur J Pharm Biopharm, 2021.
3. Grübner M. et al, Thermo Fisher Scientific Application Note 001938. Intact mass analysis of mAb charge variants by multi heart-cut 2D-LC/MS.
4. Ehkirch A. et al, An online 4D HIC×SEC-IM×MS methodology for proof-of-concept characterization of ADCs, Anal Chem, 2018.