High-Resolution Size Exclusion Chromatography of Megadalton-Sized DNA Vectors and Plasmids Using Waters GTxResolve 2000 Å SEC Columns

Význam tématu

Vývoj analytických metod pro charakterizaci velkých biomolekul je klíčový pro zajištění kvality a bezpečnosti teranostických produktů buněčné a genové terapie
Plasmidy, virové vektory a další megadaltonové struktury vyžadují šetrné separační techniky, které zachovávají jejich konformaci a minimalizují sekundární interakce
Size exclusion chromatography se díky principu separace podle hydrodynamického objemu stala standardem, avšak úspěch metody závisí na správné volbě velikosti pórů, povrchové chemie a inertního materiálu kolony

Cíle a přehled studie / článku

Studie hodnotí nové SEC kolony Waters GTxResolve 2000Å MaxPeak Premier 3 μm pro separaci megadaltonových DNA vektorů a proteinů
Cílem bylo porovnat jejich výkon s existujícími 2000Å 5 μm kolonami, ověřit rozlišení klíčových komponent, reprodukovatelnost mezi sloupci a šaržemi a potvrdit připravenost k okamžitému použití

Použitá metodika a instrumentace

Analýzy proběhly na ACQUITY Premier UPLC systému s Binary Solvent Manager, Flow-Through Needle vzorkovačem a eLambda PDA detektorem s titanovou flow cell 5 mm
Kolony: Waters GTxResolve 2000Å SEC 3 μm 4,6×150 mm a komparačně Agilent Bio SEC-5 2000Å 5 μm 4,6×150 mm
Mobilní fáze: 1× DPBS, teplota kolony 35 °C, průtok 0,1 mL/min, detekce při 260 nm
Vzorky: standardní směs DNA vektorů pBR322, phiX174 a proteinový standard thyroglobulin

Hlavní výsledky a diskuse

• Waters GTxResolve kolony dosáhly o 49 % lepšího USP rozlišení mezi pBR322 agregáty a monomerem (1,79 vs 1,20) a o 50 % lepšího rozlišení mezi pBR322 a phiX174 (5,93 vs 3,95)
• Píky byly ostré, symetrické a bez výrazných druhotných interakcí díky MaxPeak HPS a HO-PEO povrchové chemii
• Kolony z jedné šarže vykázaly %RSD retenčních časů ≤ 0,89 pro pBR322 a ≤ 0,85 pro phiX174, stabilní rozlišení kolem USP 2,1 a 5,9
• Mezibatchová reprodukovatelnost na thyroglobulinu přinesla %RSD retencí do 3,2 % a konzistentní plošné poměry monomer/dimer
• Out-of-the-box testy thyroglobulinu ukázaly změny ploch do 5,5 % a stabilní relativní retenční časy 0,97 bez nutnosti kondicionace

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje spolehlivé oddělení a kvantifikaci agregátů, monomerů a variant struktur vysoce molekulárních analyzátů
Vysoká inertnost a nízká variabilita podporují přesné hodnocení kritických parametrů kvality v procesu vývoje a kontroly výroby CGT léčiv
Kolony jsou univerzální pro nukleové kyseliny i proteiny a zvyšují efektivitu analytických workflow

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikací na lipidové nanočástice, virové vektory a další komplexní biologické makromolekuly
• Integrace SEC analýz s pokročilými detekcemi (MS, MALS, DLS) pro komplexní charakterizaci
• Optimalizace vyššího průtoku a zkrácených kolonek pro vysokoprůchodové QC analýzy

Závěr

Waters GTxResolve 2000Å SEC 3 μm kolony poskytují výrazné zlepšení v rozlišení, reprodukovatelnosti a snadném použití pro analýzu megadaltonových DNA vektorů a proteinů
Stabilní výkon usnadňuje rychlé a spolehlivé hodnocení kvality CGT produktů a podporuje vývoj bezpečnějších a účinnějších bioterapeutik

Reference

1. Youssef M, Hitti C, Puppin Chaves Fulber J, Kamen AA Enabling mRNA Therapeutics Current Landscape and Challenges in Manufacturing Biomolecules 2023 13(10):1497 doi:10.3390/BIOM13101497
2. Li T et al CRISPR/Cas9 therapeutics progress and prospects Signal Transduct Target Ther 2023 8(1):1–23 doi:10.1038/s41392-023-01309-7
3. Holladay C, Kulkarni M, Minor W, Pandit A Gene Therapy in Molecular, Cellular, and Tissue Engineering N Engl J Med 2018 381(5):56–35 doi:10.1056/NEJMRA1706910
4. Finny AS, Kizelkai L, Reidy C, Fasth M, Addepalli B, Lauber M Efficient Profiling of Lipid Nanoparticle Formulations Using Waters GTxResolve 2000Å SEC Column Application Note 720008797 Waters 2025
5. Camacho KJ et al Bridged Ethylene Polyethylene Oxide Surfaces to Improve Packing Materials for Widepore Size Exclusion Chromatography J Sep Sci 2024 47(20):e202400541 doi:10.1002/jssc.202400541