Expanding the Antibody-Oligo Conjugate (AOC) Characterization Toolbox: Part 1- OAR Analysis and Conjugation Process Monitoring

Význam tématu

Aplikace monoklonálních protilátek v kombinaci s oligonukleotidy (AOC) představuje inovativní přístup v biologické léčbě. Stanovení poměru oligonukleotidů na protilátku (OAR) je klíčové pro kontrolu biologické aktivity, stability a výrobního procesu.

Cíle a přehled studie / článku

Tato část první ze tří aplikovaných zpráv rozšiřuje analytickou paletu pro charakterizaci AOC o metody ne-denaturační LC-MS. Cílem je vyvinout workflow pro monitorování průběhu konjugace a přesné stanovení OAR pomocí SEC-MS a SCX-MS na platformě BioAccord LC-MS.

Použitá metodika a instrumentace

Pro analýzu byly připraveny dvě vzorky IgG1 protilátky navázané na dvouvláknové siRNA (OAR ~1 a ~2). Instrumentace:

• LC systém ACQUITY Premier s UPLC TUV detektorem
• Kolony: BEH C4 pro RPLC, Protein BEH SEC pro SEC, BioResolve SCX mAb pro SCX
• MS detektor ACQUITY RDa, ESI pozit., m/z 400–7000
• Mobilní fáze: 50 mM amonný acetát pH 6,8 (SEC); pH/sůl gradient IonHance CX-MS (SCX); 0,1 % FA voda/acetonitril (RPLC)
• Software UNIFI s INTACT Mass App v1.9, waters_connect

Hlavní výsledky a diskuse

RPLC-MS a SEC-MS potvrdily hmotnost volné protilátky v souladu s teoretickou hodnotou. SEC-MS u vzorků detekovalo posun hmotnosti o ~14,8 kDa a ~29,7 kDa odpovídající jednomu či dvěma navázaným oligonukleotidům. Automatické vyhodnocení OAR dalo 0,93 a 1,94. SCX-MS separovalo proteoformy dle náboje, umožnilo obdobné dekonvoluce a výpočet OAR integrací UV signálu. Komparace se SEC-MALS a AEX-MALS prokázala vynikající shodu napříč čtyřmi ortogonálními metodami. SEC-MALS zůstává vhodnější pro detekci agregátů a vysoce molekulárních forem.

Přínosy a praktické využití metody

• Ne-denaturační přístup zachovává integritu siRNA–protilátka
• Vysoce přesné stanovení OAR na benchtop ToF LC-MS systému
• Rychlá a robustní nastavení díky IonHance mobilním fázím a ověřeným kolonám
• Možnost vysokopropustné analýzy pro průběžný monitoring výrobního procesu

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace MS detekce s light-scattering technikami pro komplexní profilování
• Rozvoj metod pro lokalizaci místa konjugace (část 3 série)
• Rozšíření na další typy oligonukleotidových a malomolekulárních nákladů
• Implementace on-line procesního monitoringu v reálném čase

Závěr

Metody SEC-MS a SCX-MS na platformě BioAccord LC-MS prokázaly vysokou citlivost a přesnost při stanovení OAR a sledování konjugace AOC. Výsledky jsou plně v souladu s ortogonálními technikami SEC-MALS a AEX-MALS a umožňují efektivní podporu vývoje a kontroly kvality bioterapeutik.

Reference

1. Dovgan I. et al. Bioconjugate Chem. 30, 2483–2501 (2019)
2. Jiao J. et al. Pharmacol. Res. 209, 107469 (2024)
3. Ippoliti S. et al. Waters Application Note 720006672 (2019)
4. Shion H. et al. Waters Application Note 720007212 (2021)
5. Brandenburg C. et al. Waters-Wyatt White Paper WP8010 (2024)