Comprehensive Quantitative Analysis of Multiclass Steroids in Serum

Význam tématu

Steroidy představují zásadní skupinu endogenních metabolitů regulujících řadu fyziologických procesů. Jejich přesná kvantifikace je klíčová v klinickém výzkumu a diagnostice, přičemž konvenční imunotesty trpí omezenou analytickou specifitou. Vysokovýkonná kapalinová chromatografie v kombinaci s hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) se stává zlatým standardem díky vynikající citlivosti a selektivitě.

Cíle a přehled studie/článku

Cílem této studie bylo vyvinout robustní a automatizovaný postup pro simultánní kvantifikaci 17 endogenních steroidů a dexamethasonu v lidské séru. Metoda využívá Tecan Steroid Panel LC-MS kit v 96­-well formátu a Agilent 6495 triple quadrupole LC/MS s optimalizovanými chromatografickými i hmotnostními parametry. Výkon metody byl charakterizován z hlediska přesnosti, linearity a pravdivosti výsledků.

Použitá metodika a instrumentace

• SPE příprava vzorku: semiautomatizovaný pozitivní tlakový manuál Tecan Resolvex A200 s 96­-well NSSpect pláty a integrovanou funkcí Sample Dry s odpařovací plátem pro koncentraci analyzátů.
• Chromatografie: Agilent 1290 Infinity III s C8 kolonou Tecan (p/n 30215928), multikolonový termostat (40 °C), injekční objem 20 µL. Mobilní fáze A voda/5 mM fluorid amonný, fáze B methanol/5 mM fluorid amonný. Gradient od 45 % B na 95 % B v 9 minutách, celkový běh 10 minut.
• Hmotnostní spektrometrie: Agilent 6495 triple quadrupole s AJS ESI ionizátorem v režimu pozitivní i negativní ionizace. Sběr dat v dMRM režimu, optimalizované přechody a kolizní energie pro každý analyzát.

Hlavní výsledky a diskuse

Přesnost (CV) pro většinu analyzátů pod 10 %, v některých případech až 16 % při nízkých koncentracích, ale vždy pod akceptovatelným limitem 20 %. Linearita kalibračních křivek byla vynikající (R2 0,990–0,999), přičemž pro čtyři analyty bylo použito kvadratické fitování. Pravdivost kvantifikace byla ověřena na QC vzorcích s metrologickou stopovatelností podle ISO 17511:2020, většina analyzátů dosáhla odchylky do ±15 %. Chromatografická separace náročných párů, jako cortisone/cortisol nebo 21-deoxycortisol/corticosterone/11-deoxycortisol, byla zajištěna během jediného 10minutového běhu bez kompromisů ve výkonnosti.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaný 96­-well workflow výrazně zvyšuje propustnost a minimalizuje chyby z manuální manipulace. Metoda umožňuje rychlou a přesnou simultánní analýzu širokého panelu steroidů v klinickém výzkumu a farmaceutické kvalitě.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možnosti dalšího rozšíření zahrnují validaci metody pomocí NIST referenčních standardů, přidání dalších steroidů do panelu a integraci plně automatizovaných robotických stanic. V klinických laboratořích lze metodu adaptovat pro screening hormonálních poruch či farmakokinetické studie.

Závěr

Adaptovaný postup s Tecan Steroid Panel LC-MS kit a Agilent 6495 LC/TQ poskytuje spolehlivé, přesné a citlivé řešení pro komplexní profiling steroidů. Metoda kombinuje vysokou propustnost, nízkou variabilitu a vynikající linearitu, avšak vyžaduje validaci v každé laboratoři dle vlastních podmínek.

Reference

1. Vogeser M, Parhofer KG. Liquid Chromatography Tandem-Mass Spectrometry (LC-MS/MS) – Technique and Applications in Endocrinology. Ann Lab Med. 2007;27(5):401–410.
2. Keevil BG. Novel Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry (LC–MS/MS) Methods for Measuring Steroids. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2016;27(5):663–674.