Pushing the Boundaries of Chromatographic Separation with Inert HPLC Column Hardware

Význam tématu

Chromatografická separace biologicky relevantních molekul, zejména kyselých metabolitů a fosforylovaných peptidů, vyžaduje inertní povrch, aby se minimalizovala interakce analytu s kovovými částmi systému. Neutrální hardware zvyšuje citlivost a reprodukovatelnost analýzy.

Cíle a přehled studie

Studie hodnotí výkon HPLC kolonek Agilent Altura s Ultra Inert technologií ve srovnání s konvenčními nerezovými (SS) kolonkami. Cílem je ukázat zlepšení v intenzitě signálu, tvaru píků, chemické stabilitě a reprodukovatelnosti pro náročné aplikace v metabolomice a proteomice.

Použitá metodika a instrumentace

• Porovnání inertního a SS kolonek pomocí RP a HILIC separací na třídách látek: fosforylované peptidy, nukleotidy (AMP, ADP, ATP) a organické kyseliny (glutamin, glutamát, malát).
• Testy stability při exponování ke kyselinám, zásadám, koncentrátům PBS a iontovým párům při zvýšené teplotě.
• Hodnocení reprodukovatelnosti mezi výrobními šaržemi inertních kolonek.

• Instrumentace:
• Agilent 1290 Infinity II Bio LC System (pumpa, multisampler, kolona termostat).
• Agilent 1290 Infinity Flexible Cube pro testy stability.
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s Dual Jet Stream ESI zdrojem.
• Kapiláry MP35N a PEEK.
• Analytické kolony: Altura HILIC-Z a C18 s Ultra Inert technologií, srovnávací SS a konkurenční inertní C18.

Hlavní výsledky a diskuse

• Ultra Inert kolony přinesly 2–3× vyšší intenzitu signálu a ostřejší píky u všech testovaných analyzátů.
• Kolony odolaly agresivním chemickým podmínkám po šest týdnů s minimální ztrátou výkonu.
• Šarže inertních kolonek vykazovaly vysokou reprodukovatelnost, kdežto SS kolony měly nižší signál.
• V porovnání fosfopeptidů Altura kolony překonaly konvenční i konkurenční inertní C18 kolony při všech koncentracích.
• Kombinace inertní kolony a biokompatibilního LC systému přinesla až 25× vyšší signál než standardní LC se SS kolonou.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje spolehlivou kvantifikaci kovově senzitivních biomolekul v metabolomických, proteomických a farmaceutických aplikacích. Zvýšená citlivost a reprodukovatelnost urychluje vývoj analytických metod a zlepšuje kvalitu dat v QA/QC laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace inertních kolonek v pokročilých workflow pro hlubší analytické pokrytí a detekci nízko-abundantních látek.
• Rozšíření inertních povrchů na další komponenty LC systému pro úplnou eliminaci kovových interakcí.
• Optimalizace pro ultrarychlé a vysoce propustné (UHPLC) analýzy.

Závěr

Altura Ultra Inert kolony představují robustní řešení pro separaci kovově senzitivních látek díky potlačení interakcí s kovem, výborné chemické stabilitě a vysoké reprodukovatelnosti. Celosystémová inertnost významně zvyšuje analytickou citlivost a kvalitu chromatografických výsledků.

Reference

1. Wei T. et al. The use of HILIC Zwitterionic Phase Superficially Porous Particles for Metabolomics Analysis. LCGC Suppl. 2018, 36(6), 30–35.
2. Hsiao J. et al. Improved LC/MS Methods for the Analysis of Metal-Sensitive Analytes Using Medronic Acid as a Mobile Phase Additive. Anal. Chem. 2018, 90(15), 9457–9464.
3. Hsiao J. et al. Troubleshooting LC Separations of Biomolecules, Part 1: Background, and the Meaning of Inertness. LCGC Eur. 2020, 33(3), 122–126.
4. Fleitz A. et al. Enhanced Detection of Multiply Phosphorylated Peptides and Identification of Their Sites of Modification. Anal. Chem. 2013, 85(18), 8566–8576.
5. Winter D. et al. Citrate Boosts the Performance of Phosphopeptide Analysis by UPLC-ESI-MS/MS. J. Proteome Res. 2009, 8(1), 418–424.
6. Sandra P. et al. Analyzing Phosphorylated N-Glycans with Recovery on Bio-Inert LC Systems and PEEK-Lined HILIC Columns. LCGC Eur. 2018, 31(10), 566–571.
7. Rivera B. et al. Bioinert Versus Biocompatible: The Benefits of Different Column Materials in Liquid Chromatography Separations. LCGC Suppl. 2018, 36(6), 24–29.
8. De Pra M. et al. Effects of Titanium Contamination Caused by Iron-Free High-Performance Liquid Chromatography Systems on Peak Shape and Retention of Drugs with Chelating Properties. J. Chromatogr A 2020, 1611, 460619.