Label-free DIA-based workflow for single-cell proteomic analysis on an Orbitrap Ascend Tribrid mass spectrometer

Význam tématu

Pokročilá analýza proteomu na úrovni jedné buňky pomocí LC-MS umožňuje odhalit buněčnou heterogenitu a vnitřní funkční diverzitu, což je zásadní pro biomedicínský výzkum, farmakologii a diagnostiku.

Cíle a přehled studie

Prezentovaná práce demonstruje výkonnost systému Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC kombinovaného s Orbitrap Ascend Tribrid MS vybaveným FAIMS rozhraním při analýze nízkonákladových vzorků a jednotlivých buněk. Hlavním cílem bylo dosáhnout vysoké citlivosti, reprodukovatelnosti a průtoku 50 vzorků za den (SPD) při label-free DIA přístupu.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: HeLa proteinový digest a izolované buňky (CellenONE, proteoChip LF 48).
Chromatografie: Vanquish Neo UHPLC, Aurora UltiMate kolona 25 cm × 75 μm, průtok 0,45 μL/min, gradient 25 min (50 SPD). EASY-Spray zdroj + FAIMS Pro Duo (CV = –50).
Hmotnostní spektrometrie: Orbitrap Ascend Tribrid, Full MS 120 000 rozlišení (m/z 400–800), AGC 3,5e6, DIA scany 60 000 rozlišení, 10 segmentů, HCD 28, max IT 118 ms.
Dávkování vzorku: od 50 pg do 10 ng HeLa digestu a 1–10 buněk.

Hlavní výsledky a diskuse

• Diluce HeLa digestu: při 250 pg identifikováno až 3800 proteinových skupin a přes 5000 peptidů (Spectronaut 18), u 50 pg stále ~1300 proteinů.
• Single-cell analýza: library-free přístup umožnil identifikovat 800–1000 proteinových skupin a 2000–4000 peptidů z jedné buňky.
• Porovnání vyhledávacích strategií: Spectronaut 18 vs. Proteome Discoverer 3.1 s CHIMERYS ukázalo odlišné efektivity a šířku pokrytí, přičemž knihovní přístupy zvyšují počty identifikací, ale mohou mírně zhoršit variabilitu.
• Průtok 50 SPD znamená výrazný nárůst produktivity, přičemž citlivost systému zůstává na úrovni single-cell citlivosti.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost a nízké limity detekce vhodné pro vzorky s omezeným množstvím nebo jednotlivé buňky.
• Label-free DIA workflow – bez nutnosti značkování, úspora času i nákladů.
• Průtok 50 vzorků/den – ideální pro studie s velkým počtem vzorků a pro rutinní QA/QC procesy.
• Reprodukovatelné výsledky s nízkou variabilitou (1 % FDR, nízké CV hodnoty).

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zvyšování hloubky pokrytí proteomu pomocí optimalizace gradientů, kolonek a FAIMS parametrů.
• Integrace mikrofluidních platforem pro automatizovanou manipulaci single-cell vzorků.
• Využití umělé inteligence a strojového učení pro zpracování komplexních DIA dat a predikci funkcí proteinů.
• Aplikace v klinické proteomice, sledování biomarkerů a personalizované medicíně.

Závěr

Kombinace Vanquish Neo UHPLC s Orbitrap Ascend Tribrid MS a FAIMS rozhraním poskytuje vysoce citlivý a vysoce výkonný label-free DIA workflow pro analýzu nízkých vstupů a single-cell vzorků. Průtok 50 SPD v kombinaci s robustní identifikací proteinových skupin otevírá nové možnosti ve výzkumu buněčné heterogenity i rutinní analytice.

Reference

1. Runseng Z, Matzinger M, Mayer RL, Valenta A, Sun X, Mechtler K. A High-Sensitivity Low-Nanoflow LC-MS Configuration for High-Throughput Sample-Limited Proteomics. Anal Chem. 2023;95(51):18673-18678.