Enhancing sample throughput for deep dive proteomics with Tandem LC

Význam tématu

Přechod od klasických nano-LC-MS postupů s vysokou citlivostí k řešením s vyšší propustností vzorků je klíčový pro rozsáhlé proteomické studie. Nová tandemová nano-kapilární metoda přináší zásadní zvýšení využití hmotnostního analyzátoru a minimalizuje prostoje potřebné pro praní a připravu kolon.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ověřit výkonnost Tandem Direct Injection (TDI) workflow v porovnání s konvenčním přímým vstřikováním (DI) pro hlubokou a vysoce propustnou proteomiku. Testováno bylo značení TMTpro 18-plex i label-free vzorky v režimech DDA a DIA s ohledem na pokrytí proteomu, využití MS, reprodukovatelnost a carryover.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky představovaly HeLa digesty značené TMTpro 18-plex a neupravené digestáty pro LFQ. Workflow staví na střídání dvou nano-LC pump a dvou separačních kolon, kdy jedna kolona je v režimu chromatografie, zatímco druhá probíhá prádlo a příprava. Inteligentní editor metod na základě parametrů z Vanquish System Controlleru automatizuje načasování eluce, praní a ekvilibraci.

Použitá instrumentace

• Vanquish Neo UHPLC
• Vanquish Column Compartment N
• Two-position 6-port low-dispersion switching valves
• Vanquish Binary Pump N
• Sonation Double Barrel Oven
• Nanospray Flex ion source
• Orbitrap Exploris 480 a Orbitrap Astral MS
• PepMap Neo kolony (50–75 µm I.D., délka 15–75 cm)

Hlavní výsledky a diskuse

• TDI workflow zvýšilo využití MS z ~70 % na 93 % a propustnost až na 18 vzorků/den pro 90min gradient.
• Při polovičním průtoku 500 nL/min bylo dosaženo 62 % nárůstu citlivosti a identifikováno > 4 300 proteinových skupin z 40 ng vzorku v DIA režimu.
• TMTpro 18-plex analýzy umožnily kvantifikaci > 6 700 proteinů při 360 min gradientu; při 36 SPD přesnost kvantifikace podporoval algoritmus CHIMERYS.
• Metoda 100 SPD dosáhla o 20 % více proteinových skupin než klasický trap-and-elute protokol.
• Nulové až minimální carryover bylo dosaženo díky rozšířeným přednastaveným wash patternům bez snížení propustnosti.

Přínosy a praktické využití metody

TDI poskytuje kontinuální provoz s minimálním časem mezi vzorky, vysokou reprodukovatelností a vynikající hloubkou pokrytí proteomu. Vhodné pro rozsáhlé kohortové studie, farmaceutický výzkum, biomarkerové projekty i rutinní QA/QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace s umělou inteligencí pro optimalizaci metod, další zkracování cyklů, rozšíření na multiomické analýzy a automatizované platformy pro klinickou proteomiku.

Závěr

Tandem Direct Injection LC-MS workflow významně zvyšuje propustnost a citlivost bez kompromisu v reprodukovatelnosti či carryover. Nabízí efektivní řešení pro vysoce propustné a hluboké proteomické analýzy.

Reference

1. Zheng R. et al. Deep single-shot NanoLC-MS proteome profiling with a 1500 Bar UHPLC system, long fully porous columns and HRAM MS. J. Proteome Res. 2022, 21(10):2545–2551.
2. Stewart H. et al. Parallelized acquisition of Orbitrap and Astral analyzers enables high-throughput quantitative analysis. Anal. Chem. 2023, 95(42):15656–15664.
3. Sonation GmbH. Double Barrel Oven for Thermo Scientific NanoSpray Flex Ion Source ES071 and ES072. 2024.
4. Zheng R. et al. Fast, sensitive and reproducible nano- and capillary-flow LC-MS methods for high-throughput proteome profiling using the Vanquish Neo UHPLC system hyphenated with the Orbitrap Exploris 480 MS. Technical Note 000138, Thermo Fisher Scientific. 2021.