Protein Glycosylation Analysis Using the Agilent Cary 630 FTIR Spectrometer

Význam tématu

Proteinová glykosylace představuje klíčovou posttranslační modifikaci ovlivňující stabilitu, účinnost a imunogenitu terapeutických proteinů, zejména monoklonálních protilátek. Kontrola glykosylace je proto zásadní kvalitou v biopharmaceutickém průmyslu. FTIR spektroskopie nabízí rychlou, neinvazivní alternativu k tradičním metodám s minimální přípravou vzorku, což urychluje kontrolu kvality a snižuje provozní náklady.

Cíle a přehled studie

Studie demonstrovala využití přístroje Agilent Cary 630 FTIR k analýze globálního profilu glykosylace u různých glykoproteinů a monoklonálních protilátek (mAb). Srovnala desalted vzorky formulovaných mAb a jejich deglykosylované varianty, ověřila konzistenci mezi inovátory a biosimilary a prokázala, že FTIR signál v oblasti 1 200–950 cm–1 koreluje s obsahem sacharidů.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda kombinovala jednoduchou přípravu vzorků s ATR-FTIR analýzou:

• Spin-kolony k odstranění pufru a příprava proteinových vzorků (5 mg/mL).
• Naložení 15 µL vzorku na diamantovou ATR destičku a záznam spektra (4 000–650 cm–1, rozlišení 2 cm–1, 140/128 skenů).
• Agilent MicroLab Expert software pro odečtení vodného blanku, baseline korekci, normalizaci a integraci oblasti 1 179–965 cm–1.
• Deglykosylace pomocí PNGase F probíhala přes noc při 37 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

FTIR spektra ukázala:

• Amidové pásy I (1 600–1 800 cm–1) a II (1 470–1 570 cm–1) charakterizující proteinovou strukturu.
• Specifické glykánové absorpce v oblasti 1 200–950 cm–1, jejich intenzita odpovídala známým úrovním glykosylace jednotlivých proteinů.
• Po odbarvení pufru byly eliminovány rušivé signály excipientů, čímž se zvýšila citlivost pro glykanové pásy.
• Deglykosylace vedla k významnému poklesu absorbance v glykanové oblasti, potvrzujíc správnost FTIR čtení.

Přínosy a praktické využití metody

FTIR analýza glykosylace nabízí:

• Rychlou a neinvazivní metodu vhodnou pro rutinní QC procesy.
• Minimální přípravu vzorku bez potřeby značení nebo komplexních separací.
• Možnost porovnání inovátorů a biosimilárních forem mAb na základě globálního glykanového profilu.
• Snadné začlenění do výrobního workflow díky uživatelsky přívětivému softwaru.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Automatizace analýzy a rozšíření knihoven glykanových signatur pro přesnější kvantifikaci jednotlivých sacharidových složek.
• Integrace s online monitorováním procesů (PAT) pro včasnou detekci odchylek ve výrobě biotherapeutik.
• Pokročilé algoritmy strojového učení pro predikci biologické aktivity na základě FTIR profilů.

Závěr

Analýza proteinové glykosylace pomocí Agilent Cary 630 FTIR je efektivní, rychlá a spolehlivá metoda s minimem přípravných kroků. Umožňuje porovnávání variant monoklonálních protilátek, kontrolu kvality a podporuje rozhodování ve výrobě biopharmaceutik.

Reference

• He M.; Zhou X.; Wang X. Glycosylation: Mechanisms, Biological Functions and Clinical Implications. Signal Transduct. Target Ther. 2024, 9(1), 194.
• Derenne A.; Derfoufi K.-M.; Cowper B.; Delporte C.; Goormaghtigh E. FTIR Spectroscopy as an Analytical Tool to Compare Glycosylation in Therapeutic Monoclonal Antibodies. Anal. Chim. Acta. 2020, 1112, 62–71.
• Khajehpour M.; Dashnau J.L.; Vanderkooi J.M. Infrared Spectroscopy Used to Evaluate Glycosylation of Proteins. Anal. Biochem. 2006, 348(1), 40–48.
• Derenne A. et al. Analysis of Glycoproteins by ATR-FTIR Spectroscopy: Comparative Assessment. Methods Mol. Biol. 2021, 2271, 361–374.
• Yang Y.; Wang G.; Song T.; Lebrilla C.B.; Heck A.J.R. Resolving the Micro-Heterogeneity and Structural Integrity of Monoclonal Antibodies by Hybrid Mass Spectrometric Approaches. mAbs 2017, 9(4), 638–645.