Determination of Protein Extinction Coefficients and Concentration by UV‑Vis

Význam tématu

Stanovení extinkčních koeficientů a koncentrace bílkovin pomocí UV-Vis spektroskopie je klíčové pro vývoj a kontrolu kvality biopharmaceutik, zejména monoklonálních protilátek a vakcín. Přesné měření absorpce při 280 nm umožňuje rychlou a spolehlivou kvantifikaci proteinu v různých fázích výzkumu i výrobního procesu.

Cíle a přehled studie

Cílem popsaného Application Note bylo demonstrovat efektivitu Agilent Cary 3500 Multicell UV-Vis spektrofotometru a doprovodného softwaru Cary UV Workstation při automatizovaném výpočtu extinkčních koeficientů a koncentrací bílkovin. Studie porovnala tři proteiny (lysozym, β-casein, ovalbumin) a další monoklonální protilátky včetně inovátoru (Ristova) a dvou biosimilárů (Reditux, Truxima).

Použitá metodika a instrumentace

• Spektrofotometr: Agilent Cary 3500 Multicell UV-Vis s modu skenování 240–325 nm, šířkou pásma 2 nm, rychlostí 3000 nm/min, detektorem Multicell Peltier.
• Bankety: ultra-mikroobjemové kyvety (10 mm, 70 µl), vzorkový objem 50 µl.
• Software: Agilent Cary UV Workstation s modulárními funkcemi pro automatický výpočet rovnic Beer–Lambertova zákona a tvorbu kalibrační křivky.
• Reagencie: lysozym, β-casein, ovalbumin, guanidin hydrochlorid, inovátor a biosimiláry rituximabu, ultrapure voda.

Hlavní výsledky a diskuse

• Softwarová funkce automatického výpočtu rovnic umožnila rychlé určení extinkčních koeficientů pro všechny vzorky současně, včetně korekce základní čáry na 320 nm.
• Experimentálně stanovené koeficienty se shodovaly s hodnotami vypočtenými z amino-kyselinové sekvence i literárními daty.
• Extinkční koeficienty biosimilárů Reditux a Truxima korespondovaly s inovátorem Ristova na koncentracích 0,5 a 1 mg/ml, což potvrzuje podobné složení aromatických zbytků.
• Kalibrační křivka pro Ristova vykázala vynikající linearitu (R² = 0,9918) v rozsahu 0,1–2 mg/ml, vhodná pro sledování mAb během bioprocesního vývoje.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizace výpočtů extinkce a koncentrace zkracuje dobu analýz a minimalizuje riziko chyb operátora. Metoda je vhodná pro rutinní kontrolu kvality i výzkumné laboratoře, kde se rychle mění skladba vzorků a požaduje se vysoká reprodukovatelnost.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s LIMS a automatizovanými manipulačními systémy pro vysokokapacitní analýzy.
• Rozšíření aplikace na stanovení stability bílkovin za různých podmínek a screening interakcí protein–protein/ligand.
• Pokročilé softwarové algoritmy pro detekci agregátů a korekci rozptylu signálu.

Závěr

Agilent Cary 3500 Multicell UV-Vis a Cary UV Workstation software představují efektivní řešení pro přesné a rychlé stanovení extinkčních koeficientů a koncentrací bílkovin. Automatizované výpočty zvyšují provozní efektivitu a podporují spolehlivou analýzu ve fázi vývoje i výroby biopharmaceutik.

Reference

1. Rathore A. S. Trends Biotech. 2009;27(12):698–705.
2. Nupur N. et al. MAbs. 2018;10(1):143–158.
3. Gill S. C., Von Hippel P. H. Anal. Biochem. 1989;182(2):319–326.
4. Protein Extinction Coefficients and Concentration Calculation, NovoPro Bioscience Inc., 2025.
5. Petrat-Melin B. et al. J. Dairy Sci. 2015;98(1):15–26.
6. Lee K. H. et al. MAbs. 2018;10(3):380–396.