Deciphering the Microbiome: Targeted LC/MS/MS Analysis of Bile Acids in Biological Samples

Význam tématu

Bilirubinové kyseliny jsou klíčové pro trávení tuků a vstřebávání vitamínů rozpustných v tucích. Jejich složité metabolické dráhy zahrnují syntézu v játrech, enterohepatální cirkulaci a mikrobiální přeměnu na sekundární kyseliny. Detailní profily těchto sloučenin v biologických vzorcích jsou nezbytné pro porozumění jejich rolím v regulaci metabolismu, imunitě a patogenezi onemocnění včetně nádorových procesů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo vyvinout a validovat vysoce citlivou a robustní metodu pro cílenou kvantifikaci rozsáhlého panelu 68 bilirubinových kyselin v plazmě, séru a fecálních vzorcích. Studie představuje standardizovaný LC/MS/MS protokol na platformě Agilent 6495D triple quadrupole s iFunnel technologií a demonstruje jeho přenositelnost a reproducibilitu při dlouhodobé analýze.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: Plazma/serum (50–100 μL) a lidská feces (100 mg/mL).
• Extrakce: Kyselý acetonitril s deuterovanými interními standardy (Avanti d-BA Splash), případně Captiva EMR–Lipid kazety pro simultánní odstraňování lipidů.
• Chromatografie: Agilent Poroshell 120 EC-C18 kolona (2.1×100 mm, 1.9 μm), 18min nestandardní gradient, teplota kolony 50 °C, celkový čas běhu 23 min.
• Hmotnostní spektrometrie: Agilent 6495D TQ s čtyřgen. iFunnel, AJS ESI zdroj, MRM/dMRM v pozitivním i negativním módu, standardní iFunnel nastavení.
• Software: MassHunter 12.1 pro akvizici, MassHunter Qualitative 12.0 pro kontrolu kvality a MassHunter Quantitative 12.0 pro kvantifikaci, Agilent MPP 15.1 pro statistickou analýzu.

Hlavní výsledky a diskuse

• Chromatografické oddělení: Všechny významné isomerické a isobarické kyseliny byly separovány na bázi retence.
• Kalibrace: Linieární odpověď (R² > 0,99) v rozsahu 0,1–2 500 ng/mL pro 15 deuterovaných standardů.
• Metoda robustnosti: Po 250 po sobě jdoucích injekcích za 96 h CV ploch < 5 % a CV retenční doby 0,15 %.
• Biologické vzorky: Metoda byla úspěšně aplikována na plazmu potkanů/myší a lidské feces; PCA a hierarchické shlukování ukázaly jasné rozdíly podle druhu a pohlaví.

Přínosy a praktické využití metody

Tento standardizovaný protokol umožňuje vysoce citlivou analýzu rozsáhlého panelu bilirubinových kyselin v jediné chromatografické injekci. Je vhodný pro preklinické i klinické studie, metabolomiku, lipidomiku a výzkum mikrobiomu. Automatizovatelná extrakce se hodí pro vysokopropustné laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření panelu o další mikrobiální metabolity.
• Integrace s lipidomickými a proteomickými workflow pro holistický pohled na metabolickou síť.
• Využití ve studiích vlivu stravy, farmakoterapie a onemocnění střevního traktu.
• Implementace umělé inteligence pro pokročilé vzorové rozpoznávání a predikci biomarkerů.

Závěr

Popsaná metoda přináší komplexní, citlivou a reprodukovatelnou analýzu bilirubinových kyselin v různých biologických matricích. Díky standardizaci a robustnosti je připravena k široké aplikaci v biomedicínském a klinickém výzkumu.

Reference

• Sartain M.; et al. A Refined LC/MS/MS Method Targeting Bile Acids from the Gut Microbiome, Agilent Technologies application note, 5994-4956EN, 2023.
• Van de Bittner G. C.; et al. An Automated Dual Metabolite + Lipid Sample Preparation Workflow for Mammalian Cell Samples, Agilent Technologies technical overview, 5994-5065EN, 2022.
• Sartain M.; et al. Enabling Automated, Low-Volume Plasma Metabolite Extraction with the Agilent Bravo Platform, Agilent Technologies application note, 5994-2156EN, 2020.
• Highly Curated Workflows for Targeted Omics Using a Standardized LC/TQ Platform, Agilent Technologies flyer, 5994-7447EN, 2024.