Top-down sequencing of bispecific antibodies by electron capture dissociation on a timsOmni platform

Význam tématu

Bispecifické protilátky (bsAb) umožňují simultánní vazbu na dvě různé molekulární cíle či dva epitopy na jednom antigenu, čímž výrazně rozšiřují terapeutický a diagnostický potenciál. Jejich komplexní struktura a heterogenní proteoformní rozmanitost vyžadují analytické přístupy, které zachovávají disulfidická propojení, mapují posttranslační modifikace a nabízejí vysoké sekvenační pokrytí.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat možnosti top-down sekvenování bsAb a jejich fragmentů F(ab')2 a Fab pomocí electron capture dissociation (ECD) na platformě timsOmni. Práce se zaměřuje na ucelenou lokalizaci sekvence, přímou identifikaci O-glykosylací a potvrzení disulfidických můstků bez nutnosti předchozí redukce.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky bsAb byly připraveny řízenou výměnou Fab ramen a enzymatickou štěpnou pomocí IdeS a IgdE. Selektivní redukci disulfidických můstků provedl 2-MEA. NanoESI ionizace generovala nabití v rozsahu 20+–50+, které bylo hmotnostně filtrováno a zadrženo v buňce Omnitrap IMS Q-Omnitrap ToF. Fragmentace proběhla ECD (50 ms akumulace, ~1 eV kinetické energie, doplňkově isCID 90 eV), detekce v ToF. Data zpracoval software DataAnalysis, OmniScape a vlastní nástroje.

Hlavní výsledky a diskuse

Byly získány přehledné iontové sekvenační žebříky (E2RISL) pro F(ab')2 (~100 kDa) i Fab (~50 kDa) z bispecifické protilátky LAC49:

• Unikátní lokalizace O-glykanu (Hex(1)HexNAc(1)) na lehkém řetězci CDR3 s přesností do 5 ppm.
• Potvrzení zachování a cílené redukce disulfidických můstků, včetně interchain můstků, bez ztráty informací.
• Kompletní mapování CDR1–CDR3 pro lehký i těžký řetězec s jasným přiřazením fragmentů a PTM.

Přínosy a praktické využití metody

Platforma timsOmni ECD nabízí:

• Vysoké rozlišení sekvencí a přímou vizuální interpretaci bez rozsáhlé bioinformatické práce.
• Přesnou lokalizaci posttranslačních modifikací, zejména O-glykanů.
• Možnost mapování disulfidických vazeb a charakterizaci proteoform ve výrobním a kontrolním procesu (QA/QC).

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření workflow o kolizně indukované unfolding a MS3 pro detailní conformační analýzu a lepší proteoformní rozlišení.
• Iónová mobilitní separace před fragmentací pro odlišení blízkých konformer proteoform.
• Aplikace na další bioterapeutika a komplexní proteomické studie s vysokou heterogenitou.

Závěr

Top-down ECD na platformě timsOmni prokazuje robustní schopnost detailního sekvenování bispecifických protilátek, umožňuje jednoznačné přiřazení CDR regionů, lokalizaci PTM a mapování disulfidických můstků. Metoda překonává dřívější omezení u velkých proteoform a přináší rychlou a spolehlivou charakterizaci komplexních bioterapeutik.

Reference

• Radić L. a kol. Bispecific antibodies against the hepatitis C virus E1E2 envelope glycoprotein. Proc Natl Acad Sci U S A. 2025, doi:10.1073/pnas.2420402122
• den Boer MA, Greisch JF, Tamara S, Bondt A, Heck AJR. Selectivity over coverage in de novo sequencing of IgGs. Chem Sci. 2020, doi:10.1039/d0sc03438b