Characterization of Synthetic Peptide Drug and Impurities using High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) and Liquid Chromatography/Mass Spectrometry (LC/MS)

Význam tématu

Solid–phase peptide synthesis umožňuje masovou výrobu léčebných peptidů s vysokou čistotou, avšak vznik nečekaných vedlejších produktů může ohrozit bezpečnost a účinnost finálního léčiva. Rychlá a spolehlivá analýza syntetických peptidů, jejich degradantů a agregátů je proto klíčová pro kontrolu kvality aktivní farmaceutické složky (API) a zajištění souladu s kritickými atributy kvality (CQAs). Peptidová léčiva jako Semaglutid a Liraglutid vyžadují důkladné profilování nečistot a potvrzení molekulární integrity pomocí moderních chromatografických a hmotnostně spektrometrických technik.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit analytickou platformu kombinující jednorozměrnou (1D) a dvourozměrnou (2D) kapalinovou chromatografii spojenou s hmotnostní spektrometrií (LC/SQ–MS), která umožní:

• potvrzení přesné intact mass hlavních peptidů (Semaglutide, Liraglutide),
• profilování forced degradation produktů vzniklých při tepelném, kyselém, zásaditém a oxidačním stresu,
• rozdělení reversibilních a ireversibilních agregátů,
• určení aminokyselinového složení peptidů pomocí OPA derivatizace.

Použitá metodika a instrumentace

Studie kombinovala tyto kroky:

1. Příprava vzorků: Semaglutide a Liraglutide v koncentraci 1 mg/mL, stresové zkoušky (80 °C, HCl, H₂O₂).
2. 1D LC metodika: Agilent AdvanceBio Peptide Plus kolona, 0,4 mL/min s TFA nebo formic acid pro UV a MS komatibilní separaci.
3. 2D LC metodika: heart–cut MHC na InfinityLab Poroshell C18, 0,6 mL/min s MS–přátelskými eluenty.
4. Mass spektrometrie: Agilent InfinityLab LC/MSD iQ a LC/MSD XT pro profile scan 300–2 500 m/z, dekonvoluce intact mass v OpenLab CDS.
5. Aminokyselinová analýza: hydrolytická deaminace, OPA derivatizace, FLD detekce.

Hlavní přístroje:

• Agilent 1260 Infinity II Bio Prime LC
• Agilent 1290 Infinity II Bio 2D-LC
• Agilent InfinityLab LC/MSD iQ a LC/MSD XT
• DAD detektor se Bio-inert cartridgí

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace TFA koncentrace (0,05–0,5 %) pro Semaglutid ukázala, že 0,4 % zajišťuje dobrou separaci nečistot. 1D LC/MS potvrdila intact mass API i nízkou hladinu degradantů. 2D LC umožnila selektivně přenést vybrané oblasti chromatogramu a rozlišit reverzibilní a ireverzibilní agregáty, což se prokázalo klíčové při charakterizaci stability. MS dekonvoluce potvrdila strukturu hlavních fragmentů vzniklých při forced degradation. OPA derivatizovaná aminokyselinová analýza prokázala přítomnost standardních i nefyziologických zbytků (2-aminisobutyric acid, aminoethylethanolamine) v peptidové sekvenci.

Přínosy a praktické využití metody

Navržená LC/SQ-MS platforma nabízí:

• rychlou verifikaci intact mass API bez potřeby složitého předběžného čištění,
• detailní profilování degradantů a agregátů za podmínek simulujících reálné skladování a stres,
• možnost rozšíření na další peptidová léčiva a biopolymery díky modulární 2D LC konfiguraci,
• integrovanou aminokyselinovou analýzu pro potvrzení primární struktury.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může směřovat k:

• automatizaci vzorkových příprav a heart–cut provozu v 2D LC pro vyšší propustnost,
• aplikaci vysoko-rozlišovacích MS (Orbitrap, TOF) pro detailní lipidomické či glykoanalytické doplňky,
• implementaci multidimenzionální spektroskopie (UV–MS–FLD) pro komplexní charakterizaci modifikací peptidů,
• využití AI-řízených algoritmů dekonvoluce pro rychlejší identifikaci nečistot.

Závěr

Studie prokázala, že kombinace 1D a 2D LC spojená se single quadrupole hmotnostní spektrometrií nabízí vysoce specifický a univerzální přístup k potvrdění intact mass, profilování nečistot a agregátů peptidových léčiv. Integrovaná aminokyselinová analýza pak doplňuje komplexní kontrolu primární struktury.

Reference

1. Ryu C.-Y. Efficient Method Optimization of Semaglutide Analysis Using an Agilent 1260 Infinity II Bio Prime LC System and Blend Assist. Agilent application note 5994-7414EN, 2024.
2. Ryu C.-Y. Rapid Confirmation of GLP-1 Analog Using Agilent InfinityLab LC/MSD iQ. Application note 5994-7415EN, 2024.
3. Ryu C.-Y. Peptide Drug Stability Analysis Using Agilent InfinityLab LC/MSD and OpenLab CDS Deconvolution. Application note 5994-7500EN, 2024.
4. Ryu C.-Y. Confirmation of Peptide-Related Impurity Intact Mass Using Agilent 1290 Infinity II Bio 2D-LC and InfinityLab LC/MSD XT. Application note 5994-7654EN, 2024.
5. Ryu C.-Y. Amino Acid Composition of Peptide Drug Using Agilent 1260 Infinity II Prime LC. Application note 5994-7749EN, 2024.
6. Ryu C.-Y. Comprehensive Aggregate Profiling of Liraglutide and Semaglutide Using 1290 Infinity II Bio 2D-LC and InfinityLab LC/MSD XT. Application note 5994-7740EN, 2024.