Confirmation of Peptide-Related Impurity Intact Mass Using Agilent 1290 Infinity II Bio 2D-LC and InfinityLab LC/MSD XT

Význam tématu

Peptidové léčivé látky patří mezi dynamicky se rozvíjející třídu biotechnologických přípravků. Kontrola peptidových nečistot je klíčová z hlediska bezpečnosti a účinnosti léčiva. Nečistoty vznikající během syntézy, degradace nebo ochranných reakcí mohou ovlivnit imunitní odpověď pacienta a vést k nežádoucím účinkům. Dvourozměrná kapalinová chromatografie (2D-LC) spojená s hmotnostní spektrometrií (MS) umožňuje důkladnou charakterizaci těchto nečistot.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo potvrdit přesnou molekulovou hmotnost nečistot Semaglutidu vzniklých při nucené degradaci tepelnými a kyselými podmínkami. Studie využívá kombinaci Agilent 1290 Infinity II Bio 2D-LC a InfinityLab LC/MSD XT pro separaci, detekci a dekonvoluci MS dat. Nečistoty byly nejprve předseparovány v první dimenzi pomocí kolony AdvanceBio Peptide Plus a v druhé dimenzi pomocí Poroshell 120 CS-C18.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika kombinuje:

• 1D-LC: AdvanceBio Peptide Plus, 2,1 × 250 mm, 2,7 µm, 0,4 % TFA v mobilní fázi, gradient 0–90 % organiky v 75 min.
• 2D-LC: Poroshell 120 CS-C18, 2,1 × 100 mm, 2,7 µm, 0,1 % kyseliny mravenčí, časově řízené heart-cut.
• MS detekce: Agilent InfinityLab LC/MSD XT s ESI(+) ionizací, m/z 500–2 500, dekonvoluce v OpenLab CDS 2.8.

Instrumentace:

• Agilent 1290 Infinity II bio 2D-LC (pumpy, dvou dimenzionální ventil, DAD detektory)
• Agilent InfinityLab LC/MSD XT
• OpenLab CDS software verze 2.8

Hlavní výsledky a diskuse

Po tepelné degradaci 1 mg/mL Semaglutidu (60 °C, 2 dny) bylo identifikováno šest hlavních nečistot oddělených v 1D. Heart-cut v 2D vedl k rozlišení souběžně elujících analytů a získání čistých MS spekter i u stopových komponent.
U kyselé degradace (0,1 M HCl, 60 °C, 2 dny) bylo dosaženo podobně efektivní separace jedenácti klíčových nečistot. Dekonvoluční analýza odhalila odchylky hmotností v rozmezí –1 531 až +4 Da oproti nativnímu Semaglutidu (4 113,58 Da), což naznačuje ztráty či modifikace aminokyselin.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká selektivita a citlivost pro stopové nečistoty v biověrohodném prostředí.
• Možnost přechodu na MS-přátelské podmínky bez ztráty rozlišení.
• Jednoduchá dekonvoluce hmotnostních spekter přímo v OpenLab CDS.
• Podpora vývoje a validace generických peptidek v souladu s FDA/EMA standardy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Systémy 2D-LC/MS s rychlými ventily pro více heart-cutů a pokročilými biokompatibilními materiály budou klíčové pro komplexní proteomické a peptidomické analýzy. Integrace s vysokorychlostními Q-TOF detektory umožní detailní sekvenační identifikaci nečistot a zrychlí screening stability.

Závěr

Ukázaná aplikace potvrdila, že kombinace Agilent 1290 Infinity II Bio 2D-LC a InfinityLab LC/MSD XT poskytuje robustní nástroj pro kvantifikaci a charakterizaci peptidových nečistot. Metoda splňuje požadavky na rozlišení a citlivost potřebné při vývoji a kontrole kvality syntetických peptidů.

Reference

• ANDAs for Certain Highly Purified Synthetic Peptide Drug Products That Refer to Listed Drugs for rDNA Origin, FDA, 2021.
• Guideline on the Development and Manufacture of Synthetic Peptides, EMA, 2023.
• Pradhan R. et al. Am. J. Epidemiol. 2022, 191(8), 1352–1367.
• Liu X.; Zhai A.; Zhang B. Medicine 2022, 101(39), e30805.
• Zhang X. et al. Cell Reports 2021, 36(2), 109374.
• Sanz-Nebot V. et al. Analytica Chimica Acta 2004, 521(1), 25–36.
• De Spiegeleer B. et al. Analytical Biochemistry 2008, 376(2), 229–234.
• Chae-Young R. Agilent application note 5994-7414EN, 2024.
• Chae-Young R. Agilent application note 5994-7415EN, 2024.