Scalable Purification of a Synthetic Oligonucleotide Using Agilent PL-SAX Columns

Význam tématu

Syntetické oligonukleotidy představují klíčovou složku v oblasti genové terapie a výzkumu regulace genové exprese. Pro praktické i klinické aplikace je nezbytné dosáhnout vysoké čistoty a zpětné výtěžnosti těchto molekul. Aniontová výměnná chromatografie (AEX) nabízí robustní, škálovatelný a ekologicky šetrný přístup k purifikaci oligonukleotidů, protože nevyžaduje toxická organická rozpouštědla ani toxické iontové páry.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřuje na optimalizaci a přímé přepnutí analytických podmínek na preparativní škálu pro purifikaci 22mer 2′O-metylovaného RNA oligonukleotidu. Hlavními kroky bylo: scouting analytického gradientu, zhodnocení separačního výkonu na koloncích Agilent PL-SAX a AdvanceBio, přepočet průtoku a objemu nástřiku na preparativní podmínky a systém frakcionace pro sběr nejčistších dílčích frakcí.

Použitá metodika a instrumentace

Analytická část:

• LC systém Agilent 1290 Infinity III s vysokorychlostním čerpadlem, multisamplerem, multikolonovým termostatem a DAD detektorem pracujícím při 260 nm.
• Kolona Agilent PL-SAX 1000Å, 4,6 × 150 mm, 8 μm; mobile fáze Tris pH 8,0 (10 mM) versus 1 M NaCl.

Preparativní část:

• Preparativní LC systém Agilent 1290 Infinity II s frakcionátorem a DAD detektorem.
• Kolona Agilent PL-SAX 1000Å, 25 × 150 mm, 10 μm; lineární gradient 20→100 % NaCl během 27 minut, průtok 29,5 mL/min.

Analytická reanalýza frakcí probíhala na AdvanceBio oligonukleotidové kolonce s TEAA/ACN eluentem při 60 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

Scouting analytická metoda (20→80 % B za 30 min) potvrdila dobré rozlišení hlavního produktu od nečistot s čistotou ~85 %. Převedení na preparativní kolonu se škálováním průtoku a nástřiku vedlo k injekci až 16 mg na běh (≈2 % kapacity kolony) bez významného přetížení. Frakcionací do 16 dílčích vzorků a následnou IP-RP reanalýzou se dosáhlo jednotné čistoty hlavního produktu kolem 96 % (nejvyšší čistota 97 % ve středních frakcích). Celková kapacita preparativní kolony byla ~880 mg, což umožňuje efektivní sériové zpracování větších množství materiálu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Kompatibilitu s vodnými, nevolatilními pufry pro snížení environmentální zátěže a nízké provozní náklady.
• Jednoduché škálování z analytické (4,6 mm id) na preparativní (25 mm id) kolonu při zachování separační efektivity.
• Modulární workflow umožňující frakcionaci a selektivní kombinaci nejčistších frakcí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje zahrnují:

• Rozšíření PL-SAX živic v sys­temech kontinuální chromatografie pro hromadnou výrobu.
• Integraci inline QC a real-time monitoringu pro optimalizaci sběru frakcí.
• Vícedimenzionální chromatografické přístupy (IEX-RP) pro komplexní směsi s vyššími požadavky na čistotu.

Závěr

Studie úspěšně demonstrovala robustní a snadno škálovatelnou AEX metodu pro purifikaci 22mer syntetického oligonukleotidu. Díky použití Agilent PL-SAX kolon lze dosáhnout vysoké čistoty (>96 %) při efektivní využitelné kapacitě kolony a biokompatibilních podmínkách.

Reference

• 1. Hsiao J.; Apffel A.; Turner M. Optimizing Separation of Oligonucleotides with Anion-Exchange Chromatography, Agilent Technologies application note, 2022.
• 2. Massi J.; Lloyd L. High Resolution Separations of Oligonucleotides using PL-SAX Strong Anion-Exchange HPLC Columns, Agilent Technologies application note, 2021.
• 3. Tripodi A. A. P.; Coffey A. Superficially Porous Columns for Semi-Preparative Purification of Oligonucleotides, Agilent Technologies application note, 2024.