Analysis of Oligonucleotides with Ion Exchange Chromatography and Agilent Infinity II UHPLC

Význam tématu

Ionová výměnná chromatografie je klíčová technika pro analýzu a purifikaci oligonukleotidů v biotechnologickém a farmaceutickém průmyslu. Umožňuje rozlišení krátkých siRNA, aptamerů i dlouhých mRNA a plasmidových fragmentů, a zajišťuje spolehlivé sledování nečistot a krátkých produktů nedokončené syntézy. Robustnost vůči koncentrovaným solím a možnosti optimalizace gradientů z ní činí vyhledávanou metodu při vývoji genových terapií a přípravě výzkumných standardů.

Cíle a přehled studie / článku

Účelem aplikace bylo demonstrovat výkonnost Agilent Bio SAX a PL-SAX kolon na systému Agilent Infinity II UHPLC pro rozsáhlý rozsah oligonukleotidů. Studie ukazuje:

• Schopnost separace od 15 nt až po 10 000 bp.
• Optimalizaci eluce pomocí NaCl a NaClO4 gradientů.
• Vliv pracovní teploty, velikosti částic a rychlosti gradientu na rozlišení.

Použitá metodika a instrumentace

Analýza probíhala na Agilent 1290 Infinity II Bio UHPLC s vysokorychlostním čerpadlem a DAD detektorem UV 260 nm (G7117B). Kolony použité ve studii:

• Bio SAX NP5 PEEK 4,6 × 250 mm, 5 µm (p/n 5190-2467).
• PL-SAX 4000A 4,6 × 250 mm, 10 µm (p/n PL1551-5103).

Mobilní fáze tvořily 20 mM Tris-HCl, pH 8, a buď 1,5 M NaCl nebo 1,5 M NaClO4. Odměrné oligonukleotidové standardy zahrnovaly ssDNA ladder (15–40 nt), dsDNA ladder (100 bp a 1 kbp), RNA resolution standard (14–21 nt) a komerční markery dsDNA a PhiX174 digesty.

Hlavní výsledky a diskuse

• Porovnání Bio SAX a PL-SAX: Bio SAX neporézní částice zajišťují vysoké rozlišení až do 10 000 bp, zatímco vysoce pórovité PL-SAX slouží primárně pro frakční purifikaci větších objemů.
• Eluce NaCl vs NaClO4: NaClO4 vykazuje dvojnásobnou vychycovací sílu, zlepšuje separaci velkých dsDNA, ale u některých fragmentů může snížit rozlišení.
• Vliv teploty: Zvýšení teploty zlepšuje hmotnostní přenos a viskozitu, čímž roste retenční síla a rozlišení krátkých i dlouhých oligonukleotidů.
• Optimalizace gradientu: Pomalý NaCl gradient 0,25 % B/min významně zvyšuje rozlišení blízkých krátkých oligomerů (např. 19 vs 20 nt).
• Velikost částic: U Bio SAX může kolona s 10 µm částicemi v určitých aplikacích poskytnout lepší separaci než 5 µm, což dokládá nutnost optimalizovat podmínky pro každou velikost částic.

Přínosy a praktické využití metody

Propracovaná ionová výměnná chromatografie umožňuje:

• Jednoznačnou detekci nečistot a krátkých produktů syntézy.
• Spolehlivou purifikaci preparativních množství oligonukleotidů.
• Flexibilní přizpůsobení metodiky pro různé délky a modifikace nukleových kyselin.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj:

• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro identifikační analýzy.
• Automatizované optimalizace gradientů a teplotních profilů pomocí umělé inteligence.
• Vývoj nových stacionárních fází s vyšší kapacitou a selektivitou pro modifikované či konjugační oligonukleotidy.

Závěr

Agilent Infinity II UHPLC vybavená Bio SAX a PL-SAX kolonatoří dokumentuje vysokou flexibilitu a rozlišení pro širokou škálu oligonukleotidů. Navržené parametry eluce, teploty i velikosti částic slouží jako výchozí body pro další optimalizaci a přizpůsobení specifickým analytickým či purifikačním úlohám.

Reference

1. Vanhoenacker G et al Evaluation of Different Ion-Pairing Reagents for LC/UV and LC/MS Analysis of Oligonucleotides Agilent Technologies application note 5994-2957EN 2021
2. Duong P et al Fast and High-Resolution Reversed-Phase Separation of Synthetic Oligonucleotides Agilent application note 5991-6006EN 2017
3. Massie J Lloyd L High-Resolution Separations of Oligonucleotides Using PL-SAX Strong Anion-Exchange HPLC Columns Agilent application note 5990-8297EN 2021
4. Bonilla JV Srivatsa GS Eds Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products CRC Press 2016
5. LeRouge E et al The Investigation of DNA and RNA Structural Differences Using Ultra High Performance Liquid Chromatography SUNY Albany Honors Thesis 2016