Mitigation of Non-Specific Adsorption During Column Conditioning for an Oligonucleotide HILIC Analysis

Význam tématu

Analýza oligonukleotidů je klíčová pro vývoj genetických výzkumů a terapeutik. Hydrofobní interakce v HILIC chromatografii nabízejí ekologičtější alternativu k iontově párované reverzní fázi, nicméně nešpecifická adsorpce na kovových površích může výrazně ovlivnit kvalitu dat a návratnost vzorků.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo porovnat tradiční HPLC systémy a kolony ze nerezové oceli s platformou MaxPeak HPS (High Performance Surfaces) pro minimalizaci nešpecifické adsorpce oligonukleotidů za HILIC podmínek a vyhodnotit jejich dopad na obnovu a tvar chromatografických špiček.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: Waters MassPREP OST Standard (oligonukleotidy 15–35 mer), 40 pmol pro standard, 160 pmol pro passivaci
• Systémy: Alliance iS HPLC (nerezová ocel) vs Alliance iS Bio HPLC (MaxPeak HPS, korozivzdorná slitina MP35N)
• Kolony: XBridge BEH Amide 2,5 µm 4,6×100 mm (stainless steel) vs XBridge Premier BEH Amide 2,5 µm (MaxPeak HPS)
• Podmínky: detektor TUV 260 nm, 5 Hz, tok 1,0 mL/min, teplota kolony 60 °C, mobile phase voda/acetonitril/50 mM ammonium acetát pH 6,7
• Software: Empower 3.7.0 pro zpracování dat

Hlavní výsledky a diskuse

• Bez HPS a bez passivace: nízké plochy špiček a nestabilní retence vinou nešpecifické adsorpce
• Passivace nerezových povrchů: plná obnova signálu, ale časově náročný a dočasný proces
• MaxPeak HPS kolona + nerezový systém: snížení adsorpce na koloně, systém však stále adsorpční, recovery ~57 %
• Stainless-steel kolona + MaxPeak HPS systém: obdobné výsledky jako bez HPS kolony – klíč je technologie na koloně
• MaxPeak HPS kolona + MaxPeak HPS systém: vysoká počáteční recovery ~98 %, nízké RSD, zřetelně lepší tvar a reprodukovatelnost špiček

Přínosy a praktické využití metody

• Okamžité „out-of-the-box“ nasazení bez dodatečné passivace
• Snížení použití toxických rozpouštědel a provozních nákladů
• Zvýšení robustness a konzistence analýz oligonukleotidů v biomedicínských i průmyslových aplikacích

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj se zaměří na rozšíření HPS technologie na další bioanalytické metody a na optimalizaci průtokových cest pro minimalizaci kontaktu citlivých biomolekul s kovovými povrchy. Kombinace s automatizovanými a miniaturizovanými systémy může zvýšit propustnost a efektivitu laboratorních postupů.

Závěr

Studie ukázala, že integrování MaxPeak HPS technologie v systému i koloně významně potlačuje nešpecifickou adsorpci oligonukleotidů, zvyšuje obnovu vzorků, snižuje potřebu časově náročné passivace a zlepšuje tvar a reprodukovatelnost špiček. Tento přístup je vysoce přínosný pro přesné a udržitelné chromatografické analýzy v oblasti genové terapie a personalizované medicíny.

Reference

1. Grumbach E. S., Fountain K. J. Comprehensive Guide to HILIC, Waters Corporation, 2010.
2. Gilar M., DeLano M., Gritti F. Mitigation of Analyte Loss on Metal Surfaces in LC, J Chrom A, 2021, 1650, 462247.
3. Lardeux H. et al. Impact of Low Adsorption Surfaces for DNA and RNA Oligonucleotides, J Chrom A, 2022, 1677, 463324.
4. Tuytten R. et al. Stainless Steel Electrospray Probe: a Dead End for Phosphorylated Organic Compounds, J Chrom A, 2006, 1104, 209–221.
5. Brennan K., Trudeau M., Rainville P. Utilization of the ACQUITY Premier System for Improved Oligonucleotide Performance, Waters App. Note, 2021.