Improving Recovery and Quantitation of Oligonucleotide Impurities Using ACQUITY PREMIER with MaxPeak HPS Technology

Význam tématu

Ion-pair reverzní fázová chromatografie je standardní metodou pro separaci syntetických oligonukleotidů. V praxi však oligonukleotidy vykazují silnou afinitu k kovovým povrchům LC systému, což vede k nízké obnově a špatné opakovatelnosti při kvantifikaci stopových impurit. Optimalizace povrchů a minimalizace tohoto jevu je proto klíčová pro spolehlivý vývoj a kontrolu kvality nukleových terapeutik.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo porovnat výkon konvenčních nerezových kolón a LC systémů s řešením ACQUITY PREMIER, využívajícím technologii MaxPeak HPS. Studie hodnotila:

• okamžitou připravenost k analýze bez passivace či conditioning,
• obnovu a citlivost při detekci stopových n-1 impurit,
• rozsah dynamické linearity a opakovatelnost kvantifikace při nízkých hmotnostních náloží.

Použitá metodika a instrumentace

• LC systémy: ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio Binary System a ACQUITY PREMIER System s technologií MaxPeak HPS
• Kolony: ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18, 130 Å, 1.7 µm, 2.1×50 mm versus ACQUITY PREMIER Oligonucleotide C18, 130 Å, 1.7 µm, 2.1×50 mm
• Mobilní fáze: A) 100 mM TEAA pH ~7 nebo B) 8.6 mM TEA + 100 mM HFIP pH ~8.25; organický rozpouštědlo: acetonitril nebo methanol
• Podmínky: teplota kolony 60 °C, průtok 0.20 ml/min, detekce TUV 260 nm, objem injekce 4 µl
• Softwarová podpora: Empower 3 Chromatography Data Software FR4

Hlavní výsledky a diskuse

1) Odstranění conditioning: ACQUITY PREMIER kolona umožnila detekci n-1 impurity FAM-25mer již od první injekce (0.1 %, RSD 2.4 %), zatímco u nerezové kolony bylo nutné složité pasivování LC systému kyselinou fosforečnou.
2) Rozsah a linearita: Při dvou-násobném ředění GEM91 až po SNR <3 vykázala konvenční soustava nejnižší obnovu a nejhorší linearitu. Pouze kombinace Premier kolony a Premier systému zajistila nejvyšší obnovu (až 4× u GEM91), tři řády dynamického rozsahu a nízké RSD i při stopových náložích.
3) Široká použitelnost: Testy na standardu MassPREP (dT 15–35 nt), FAM-25mer a Cy3-25mer potvrdily nárůst obnovy 1.5–2× u nepřebarvených sekvencí a 1.6–2× u fluorescentně modifikovaných oligonukleotidů, přičemž u plně fosforotioátového GEM91 byl zaznamenán až 4× nárůst signálu.

Přínosy a praktické využití metody

• Okamžité nasazení bez časově náročného conditioning či agresivního passivování LC systému
• Vyšší citlivost a nižší limity detekce
• Rozšířený dynamický rozsah a lepší linearita kvantifikace impurit
• Spolehlivá opakovatelnost (nízké RSD) napříč různými typy oligonukleotidů

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší nasazení MaxPeak HPS povrchů pro další kovově senzitivní analyty, včetně peptidů a proteinů. Integrace s hmotnostní spektrometrií a vyvíjejícími se biofarmaceutickými formáty přinese další zvýšení citlivosti. Dlouhodobá stabilita povrchů a možnost automatizace pasivace otevírá nové cesty pro vysokokapacitní rutinní analýzy v GMP prostředí.

Závěr

ACQUITY PREMIER řešení s technologií MaxPeak HPS významně zlepšuje obnovu a kvantitativní spolehlivost analýzy oligonukleotidů. Eliminace conditioning, zvýšená citlivost a rozšířený dynamický rozsah přinášejí robustní platformu pro výzkum i výrobní QA/QC procesy.

Reference

1. DeLano M., Walter T. H., Lauber M. A. a kol. Using Hybrid Organic-Inorganic Surface Technology to Mitigate Analyte Interactions with Metal Surfaces in UHPLC. Anal. Chem. 2021.
2. Zhou W., Saran R., Liu J. Metal Sensing by DNA. Chem. Rev. 2017, 117(12), 8272–8325.