Single-Shot LC-MS Workflow for Comprehensive Proteome Identification on an Orbitrap Astral Mass Spectrometer

Význam tématu

Komplexní a rychlá analýza proteomu je zásadní pro porozumění buněčné funkci, identifikaci biomarkerů a hodnocení účinků léčiv. Tradiční metody s prefrakcionací prodlužují analýzu a zvyšují variabilitu mezi vzorky. Moderní přístupy bez frakcionace výrazně zkracují dobu analýzy a zvyšují průchodnost při zachování hloubky pokrytí proteomu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout end-to-end jednorázové LC-MS workflow využívající label-free DIA na novém Orbitrap Astral spektrometru spojeném s Vanquish Neo UHPLC systémem. Metoda byla testována na jedenácti běžných lidských buněčných liniích, aby se zhodnotila hloubka proteomu, kvantifikační přesnost a průchodnost analytického systému.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorků: Kultivace 11 buněčných linií, lyze EasyPep bufferem, odhad proteinů metodou BCA, trysková digesce a čištění pomocí AccelerOme platformy.
• Chromatografie: 60min gradient na µPAC Neo 50 cm sloupci (perorální exploze 180 µm, mezery 16 µm) s trap-elute uspořádáním a PepMap C18 15 cm analytickou kolonkou (150 µm i.d.).
• MS akvizice: Orbitrap Astral pracující ve full MS 240 000 FWHM, AGC target 500 %, scan m/z 380–980; DIA MS2 v Astral analyzátoru s okny 2 Th, 3,5 ms injekční čas, m/z 150–2000.
• Data processing: Proteome Discoverer 3.1 s CHIMERYS INFERYS predikčním modelem v directDIA režimu proti lidské UniProt databázi (1 % FDR). Výpočet CV založen na biologických trojicích.

Hlavní výsledky a diskuse

• Identifikováno 8 500–10 300 proteinových skupin na linie (např. A549: ~10 300, HCT116: ~9 700, HEK293T: ~9 300) a 114 000–146 000 peptidů.
• Optimalizace průchodnosti: 60, 100, 180 a 300 vzorků za den (SPD) zachovala vysokou hloubku proteomu, nejvyšší výkon ~10 300 proteinů a 146 000 peptidů při 300 SPD.
• Kvantifikační přesnost: Medianní CV proteinových skupin ~4–5 % pro standardní HeLa digest při 60–180 SPD, ~11–13 % pro peptidy; u buněčných linií ~10 % CV.
• Reprodukovatelnost a robustnost metody potvrzeny biologickými replikáty a jednotlivými dny analýzy.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zvýšení průchodnosti bez kompromisů v hloubce proteomu, umožňující analýzu středně až velkých kohort (>5 000 vzorků měsíčně na jeden MS systém).
• Label-free DIA přístup bez nutnosti předchozích knihoven zjednodušuje workflow a snižuje režijní náklady.
• Aplikace ve výzkumu nádorových buněk, toxikologii, farmacii a kvalitní kontrole biologických materiálů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zvyšování průchodnosti přes 300 SPD s optimalizovanými gradienty a rychlejšími kolonami.
• Integrace umělé inteligence pro predikci spektér a automatizaci identifikace bez nutnosti rozsáhlých databází.
• Přechod k malým a ultra-rychlým sloupcům pro mikroprůtokové UHPLC a miniaturizované MS systémy.
• Využití pro klinické kohortní studie s potřebou vysoké škálovatelnosti a konzistence dat.

Závěr

Studie prokázala, že jednorázové LC-MS workflow na Orbitrap Astral spektrometru spojeném s Vanquish Neo UHPLC a AccelerOme přípravou vzorků nabízí rychlou, robustní a reprodukovatelnou hlubokou proteomiku. Metoda splňuje požadavky na vysokou průchodnost i analytickou hloubku a nachází široké využití v akademickém i průmyslovém prostředí.

Reference

1. Wang H, Yang Y, Li Y, Bai B, Wang X, Tan H, Liu T, Beach TG, Peng J, Wu Z. Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome. J Proteome Res. 2015, 14, 829-38.
2. Meier F, Geyer PE, Virreira Winter S, Cox J, Mann M. BoxCar acquisition method enables single-shot proteomics at a depth of 10,000 proteins in 100 minutes. Nat Methods. 2018, 15, 440-448.
3. Stejskal K, Op De Beeck J, Matzinger M, Dürnberger G, Boychenko A, Jacobs P, Mechtler K. Deep Proteome Profiling with Reduced Carryover Using Superficially Porous Microfabricated nanoLC Columns. Anal Chem. 2022, 94, 15930-15938.