Easy, fast and reproducible analysis of host cell protein (HCP) in monoclonal antibody preparations

Význam tématu

Monitoring a stanovení hostitelských buněčných proteinů (HCP) v přípravcích monoklonálních protilátek je klíčové pro zajištění bezpečnosti, účinnosti a stability bioterapeutik. Přítomnost nechtěných HCP může vést k degradaci léčivé bílkoviny, změnám v její glykozylaci či dalším modifikacím, které mohou ovlivnit farmakologické vlastnosti a imunogenicitu produktu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout rychlou, vysoce reprodukovatelnou a automatizovanou metodiku pro analýzu HCP v monoklonálních protilátkách, která zároveň využívá standardní pracovní postup pro peptidové mapování. Využití jediné platformy pro oba typy analýz má zkrátit dobu přípravy vzorků a zjednodušit validaci metody.

Použitá metodika a instrumentace

Pro automatizovanou digesci bylo využito kit SMART Digest s magnetickou pryskyřicí a přístroj KingFisher Duo Prime. Vzorky (adalimumab) se ve třech paralelních sadách zpracovaly v dvou koncentracích (5 µg pro peptidové mapování, 160 µg pro HCP), digesce probíhala při 70 °C po dobu 45 minut. Po redukci disulfidů DTT byly vzorky acidifikovány a separovány pomocí Vanquish Flex UHPLC systému s kolonkou Acclaim VANQUISH C18 (2,1 × 250 mm, 2,2 µm) a mobilní fází 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě/acetonitrilu. Detekce byla prováděna na Q Exactive Plus Orbitrap, data zpracována v Biopharma Finder a PEAKS Studio.

Hlavní výsledky a diskuse

• Automato­vaná digesce vykázala vynikající reprodukovatelnost chromatogramů i MS signálu při nízkých i vysokých náložích.
• Při zvýšení nálože z 5 na 160 µg došlo k mírnému snížení chromatografického rozlišení, asymetrie a selektivity (< 30 %), avšak stále v akceptovatelných mezích.
• Metoda identifikovala 51 různých HCP, z toho šest proteinů na základě dvou a více unikátních peptidů.
• Mezi identifikovanými kontaminanty byl proteolytický enzym kathepsin L1, schopný cíleně štěpit v místě His-Thr v horní oblasti hinge-regionu protilátky.
• Relativní kvantifikace ukázala koncentraci kathepsinu L1 kolem 4 ppm (ng HCP na mg terapeutické bílkoviny).

Přínosy a praktické využití metody

• Zkrácení doby přípravy vzorků díky plné automatizaci digesce.
• Možnost využití jednoho pracovního postupu pro peptidové mapování i HCP analýzu.
• Vysoká citlivost a spolehlivost detekce nízce abundantních HCP.
• Zvýšení reproducibility a snížení variability mezi běhy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj automatizovaných platforem s vyšší propustností a integrací akcí digesce, separace a detekce. Využití datově nezávislé akvizice (DIA), pokročilých bioinformatických algoritmů a strojového učení pro hlubší charakterizaci a kvantifikaci HCP dále zefektivní kontrolu kvality. Nové typy enzymatických pryskyřic a miniaturizované analytické systémy umožní snížení spotřeby vzorku a spotřebního materiálu.

Závěr

Automatizované řešení SMART Digest/KingFisher Duo Prime v kombinaci s Vanquish UHPLC a Orbitrap MS poskytuje robustní, reprodukovatelnou a citlivou metodiku pro analýzu HCP v monoklonálních protilátkách. Identifikace a kvantifikace klíčových proteáz, jako je kathepsin L1, pomáhá vysvětlit mechanizmy degradace léčivých bílkovin a podporuje optimalizaci výrobního a kontrolního procesu.

Reference

1. Kim JY, Kim YG, Lee GM. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Appl Microbiol Biotechnol. 2012;93:917–930. doi:10.1007/s00253-011-3758-5
2. Tscheliessnig AL, Konrath J, Bates R, Jungbauer A. Host cell protein analysis in therapeutic protein bioprocessing - methods and applications. Biotechnol J. 2013;8:655–670. doi:10.1002/biot.201200018
3. Gronemeyer P, Ditz R, Strube J. Trends in upstream and downstream process development for antibody manufacturing. Bioengineering. 2014;1:188–212. doi:10.3390/bioengineering1040188
4. Shukla AA, Jiang C, Ma J, et al. Demonstration of robust host cell protein clearance in biopharmaceutical downstream processes. Biotechnol Prog. 2008;24:615–622. doi:10.1021/bp070396j
5. Rathore AS, Sobacke SE, Kocot TJ, et al. Analysis for residual host cell proteins and DNA in process streams of a recombinant protein product expressed in Escherichia coli cells. J Pharm Biomed Anal. 2003;32:1199–1211
6. Doneanu C, Xenopoulos A, Fadgen K, et al. Analysis of host-cell proteins in biotherapeutic proteins by comprehensive online two-dimensional LC/MS. MAbs. 2012;4:24–44. doi:10.4161/mabs.4.1.18748
7. Zhu-Shimoni J, Yu C, Nishihara J, et al. Host cell protein testing by ELISAs and the use of orthogonal methods. Biotechnol Bioeng. 2014;111:2367–2379. doi:10.1002/bit.25327
8. Kreimer S, Gao Y, Ray S, et al. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of DIA MS data with PRM verification. Anal Chem. 2017;89:5294–5302. doi:10.1021/acs.analchem.6b04892
9. McGivney JB, Csordas AT, Walker FM, et al. Strategy for generating sequence-defined aptamer reagent sets for detecting protein contaminants in biotherapeutics. Anal Chem. 2018;90:3262–3269. doi:10.1021/acs.analchem.7b04775
10. Kumar A, Baycin-Hizal D, Wolozny D, et al. Elucidation of the CHO super-ome (CHO-SO) by proteoinformatics. J Proteome Res. 2015;14:4687–4703. doi:10.1021/acs.jproteome.5b00588
11. Füssl F, Trappe A, Cook K, et al. Comprehensive characterisation of the heterogeneity of adalimumab via charge variant analysis hyphenated on-line to native high resolution Orbitrap MS. MAbs. 2019;11:116–128. doi:10.1080/19420862.2018.1531664