Determination of six steviol glycosides using reversed phased HPLC and online SPE

Význam tématu

Stéviolové glykosidy představují přírodní sloučeniny s výraznou sladivostí až 400krát vyšší než sacharóza. Díky nulovým kaloriím a přírodnímu původu nacházejí uplatnění jako náhradní sladidla ve farmaceutickém, potravinářském i výzkumném prostředí. Rychlá a spolehlivá kvantifikace jednotlivých glykosidů je klíčová pro kontrolu kvality finálních výrobků a sledování kontinuity výrobních procesů.

Cíle a přehled studie

Cílem byla optimalizace a integrace existující reverzněfázové HPLC metody pro šest hlavních stéviolových glykosidů se solid phase extraction (SPE) v online režimu. Studie navazuje na předchozí metodu s manuálním SPE a převádí ji do plně automatizovaného formátu, čímž se zkracuje čas přípravy vzorku a zvyšuje propustnost analytického provozu.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda využívá gradientní eluce vody a acetonitrilu na hlavním C18 sloupci. Příprava vzorku zahrnuje extrakci sušených listů stevie, následné online SPE s automatickým přepínáním ventilů pro nabíjení, mytí a eluční fázi. Eluát je převeden na analytický sloupec a detekován UV detektorem při 210 nm.

Použitá instrumentace

• HPLC systém AZURA se SPE modulem ASM 2.1L
• Autosampler AS 6.1L
• Gradientní pumpa P 6.1L
• Kolonová termostatizace CT 2.1L
• Diodový array detektor DAD 2.1L
• Hlavní kolona Vertex Plus Eurospher II 100-5 C18 (250×4,6 mm)
• SPE kolona Vertex Plus Eurospher II 100-5 C18 (30×4,6 mm)

Hlavní výsledky a diskuse

Online SPE přidává pouze tři minuty k původnímu 12minutovému běhu HPLC, přičemž efektivně odstraňuje matrici a chrání hlavní kolonu před znečištěním. Monitoring průtoku ukázal, že mycí fáze odstraňuje interferující složky dříve než dojde k eluci analytů na HPLC kolonu. Kalibrace ve škále 0,01–0,15 mg/mL pro jednotlivé glykosidy prokázala lineární odezvu a reprodukovatelnost s objemem injekce 20 µL.

Přínosy a praktické využití metody

• Zkrácení celkového času analýzy a přípravy vzorku
• Redukce manuální práce spojené s tradičním SPE
• Vyšší propustnost laboratoře při kontrole kvality
• Prodlužení životnosti analytického sloupce díky redukci matrix load

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může směřovat k ještě vyšší automatizaci sběru dat a integraci s laboratorními informačními systémy. Možné je rozšíření o hmotnostní detekci pro potvrzení struktur glykosidů a implementace podobného online SPE přístupu pro další přírodní extrakty a potravinářské matrice.

Závěr

Integrace online SPE do reverzněfázové HPLC analýzy stéviolových glykosidů poskytuje rychlý, spolehlivý a vysoce propustný postup pro kontrolu kvality stévie. Automatizace předanalytické fáze zkracuje dobu analýzy a minimalizuje lidský faktor, přičemž chrání hlavní kolonovou cestu před znečištěním.

Reference

[1] Samuel P., Ayoob K.T., Magnuson B.A. et al. Stevia Leaf to Stevia Sweetener: Exploring Its Science, Benefits, and Future Potential. Journal of Nutrition, 148(7):1186S–1205S, 2018.