Reducing Cycle Time for Affinity Removal of High-Abundant Proteins in Human Plasma

Význam tématu

Deplece vysoce zastoupených proteinů z lidské plazmy je klíčová pro rozšíření dynamického rozsahu v proteomických analýzách. Odstraněním nejhojnějších 14 proteinů se snižuje iontové potlačení při hmotnostní spektrometrii, což zlepšuje detekční limity a kvantifikaci slabě zastoupených biomarkerů.

Cíle a přehled studie / článku

Studie demonstruje zkrácení celkového času jednoho cyklu deplece o 32 % díky paralelní regeneraci dvou afinitních sloupců pomocí kombinace Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC, 1290 Infinity Flexible Cube a 1200 Infinity Quick-Change Bio-inert ventilu. Cílem je zvýšit průchodnost vzorků při zachování vysoké přesnosti a reprodukovatelnosti.

Použitá instrumentace

• Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary Pump
• Agilent 1260 Infinity Bio-inert High-Performance Autosampler
• Agilent 1260 Infinity DAD VL (bio-inert flow cell)
• Agilent 1260 Infinity Bio-inert Fraction Collector
• Agilent 1290 Infinity Flexible Cube s bio-inert pístovým čerpadlem
• Agilent 1200 Infinity Series Quick-Change Bio-inert 2-position/10-port ventil
• Termostaty pro vzorky a kolony, bio-inertní kolónový termostat
• Agilent Human 14 Multiple Affinity Removal System (MARS) kolony

Použitá metodika

Lidská plazma byla naředěna PBS a aplikována na MARS kolonu (4,6×50 mm) metodou podle návodu výrobce. Pro vazbu antigen–protilátka se použil průtok 0,125 mL/min. Eluce odvázaných proteinů proběhla při 1 mL/min. Paralelní regenerace druhé kolony byla zajištěna bio-inertním pístovým čerpadlem při nízkém tlaku. Vzorek (80 µL) se analyzoval gradientem 0 %–100 % eluačního pufru během 17 minut.

Hlavní výsledky a diskuse

Overlay sedmi po sobě jdoucích injekcí na jedné kolonie prokázalo RSD retenčního času < 0,08 % a plochy < 0,86 %. Při střídavém nasazení dvou kolon bylo dosaženo RSD RT < 0,13 % a RSD plochy < 1,05 %. Současná regenerace jedné kolony při analýze druhé umožnila úsporu cca 8 minut na běh, tedy 32 % zkrácení celkového času.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zvýšení průchodnosti vzorků (throughput)
• Vysoká intra- a interkolonová přesnost měření
• Úplně bio-inertní průtoková cesta zabraňuje korozi a uvolňování kovů
• Snížení spotřeby elučních pufrů a zátěže na údržbu systému

Budoucí trendy a možnosti využití

Alternující regenerace sloupců lze rozšířit na další biofluidy; integrace s automatizovanými přípravami a hmotnostní spektrometrií zvýší multiplexní kapacitu. Další rozvoj v oblasti vysokopropustných proteomických platforem povede ke zkrácení doby analýzy a úspoře nákladů.

Závěr

Demonstrované řešení paralelní regenerace MARS kolon s bio-inertními moduly Agilent LC systému umožňuje zkrácení cyklu deplece o 32 % při zachování špičkové reprodukovatelnosti a stability měření. Platforma je vhodná pro vysoce průchodné proteomické workflow.

Reference

• 1. Anderson L. Candidate-based proteomics in the search for biomarkers of cardiovascular disease. J Physiol. 2005;563(Pt 1):36-60.
• 2. Agilent Technologies. Human Serum and Plasma Protein Depletion – Novel High-Capacity Affinity Column for the Removal of the Top 14 Abundant Proteins. Application Note 5989-7839EN; 2008.
• 3. Agilent Technologies. Affinity removal of the 14 most abundant proteins in human plasma using the Agilent 1260 Infinity Bio-inert LC System. Application Note 5991-3207EN; 2013.