Deformulating Size Exclusion Chromatography for LNP Payload Quantitation

Význam tématu

V současné fázi rozvoje genové a buněčné terapie představují lipidové nanočástice jako nosiče mRNA zásadní roli při dodání terapeutického nákladu. Spolehlivá a rychlá analýza obsahu mRNA uvnitř LNP je klíčová pro kontrolu kvality, optimalizaci výrobních procesů a zajištění bezpečnosti finálního produktu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout rychlou a univerzální metodu online deformulace LNP a následné separace a kvantifikace uvolněné mRNA pomocí SEC-UV. Autoři zkoumali nedostatky běžných protokolů s detergentem Triton X-100 a navrhli mobilní fázi obsahující aniontový detergent a organické rozpouštědlo, které eliminují potřebu samostatné přípravy vzorku.

Použitá metodika a instrumentace

Analýzu realizovali na UPLC systému s kvaternárními pumpami a UV detektorem nastaveným na 260 a 230 nm. Pro separaci byl nasazen sloupec GTxResolve Premier BEH SEC 450 Å o rozměrech 4,6 × 150 mm při teplotě kolony 40 °C a teplotě vzorku 6 °C. Mobilní fáze sestávala z fosfátového pufru PBS (pH 7,4) s 20 % isopropanolem a 0,2 % SDS, filtrována přes 0,2 µm membránu. Objem injekce činil 0,1–1,0 µL při průtoku 0,25–0,5 mL/min.

Hlavní výsledky a diskuse

Native SEC potvrdila zachování struktury LNP a nemožnost spolehlivě oddělit volnou mRNA od intaktních částic. Offline deformace Tritonem vedla k částečné denaturaci a interferencím v chromatogramu. Implementací SDS a isopropanolu do mobilní fáze došlo k úplné inline deformulaci LNP při injekci, s A260/230 poměrem blízkým hodnotám čisté RNA. Optimalizace parametrů (40 °C, 0,2 % SDS) zajistila vysokou návratnost a robustní separaci různě velkých mRNA (>2 000 nt až 5 000 nt).

Přínosy a praktické využití metody

• Není potřeba samostatná příprava vzorku ani offline extrakce.
• Rychlý průběh analýzy do 10 minut.
• Možnost simultánního rozlišení a kvantifikace více mRNA v jedné aplikaci.
• Vysoká reprodukovatelnost a snadná implementace v rutinních laboratořích QA/QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda lze rozšířit na hodnocení komplexních LNP pro genové editace nesoucích kombinaci Cas mRNA a guide RNA. Dalším krokem je přizpůsobit různé pórovitosti SEC sloupců (např. 1000 Å) k dosažení vyšší rozlišovací schopnosti a aplikovat podobný přístup na proteinové nebo virové nanočástice.

Závěr

Vyvinutá online deformující SEC-UV metoda umožňuje rychlou, efektivní a kvantitativní analýzu mRNA v LNP bez nutnosti složité přípravy vzorku. Klíčovým prvkem je vhodně zvolená mobilní fáze s SDS a isopropanolem, která zajišťuje úplnou denaturaci a přímo na kolonu uvolněnou mRNA oddělí podle velikosti.

Reference

1. Sparmann A, Vogel J EMBO J 2023;42(21):e114760
2. Jia X et al. J Chrom B 2021;1186:123015
3. Porterfield JZ, Zlotnick AA Virology 2010;407(2):281–288
4. SCIEX Application Note Biopharma mRNA Assessment
5. Fekete S et al. Trends Anal Chem 2023;117088
6. Fekete S et al. J Pharm Biomed Anal 2023;224:115174
7. Zhang J et al. Anal Chem 2012;84(14):6088–6096
8. Packer M et al. Nat Commun 2021;12:6777
9. Koetsier G, Cantor E New England Biolabs Tech Note 2019
10. Ramirez-Cuevas I, Papakonstantinou I ACS Photonics 2022;9(2):672–681
11. Muramatsu H et al. Mol Ther 2022;30(5):1941–1951
12. D’Atri V et al. Int J Mol Sci 2024;25:6254