Multi-attribute quantification of LNP-mRNA therapeutics by FFF-MALS and DLS

Význam tématu

Vývoj a kontrola kvality léčiv založených na mRNA zapouzdřené v lipidových nanočásticích (LNP) vyžaduje kvantifikaci více kvalitativních a kvantitativních atributů současně: velikostní distribuce LNP, koncentrace částic, obsah lipidů a mRNA a závislost nálože mRNA na velikosti částic. Standardní metody (barvicí testy, NTA, cryo-EM, hmotnostní spektrometrie, UV/vis, DLS) buď neposkytují dostatečné rozlišení, nebo jsou pracovně náročné. Kombinace asymetrické/field-flow fractionation (FFF) s multi-úhlovým rozptylem světla (MALS) a doplňujícími detektory nabízí automatizovanou, vysoce přesnou alternativu schopnou současně určit více atributů v jednom běhu.

Cíle a přehled studie

Autoři demonstrovali použití metody FFF-MALS-D dRI-UV (označované jako MAQ – multi-attribute quantification) pro kvantifikaci více atributů u dvou bivalentních LNP-mRNA vakcín proti COVID-19 (Comirnaty/Pfizer-BioNTech a Spikevax/Moderna). Konkrétní cíle zahrnovaly přesné určení velikostní distribuce, koncentrace částic, molárních hmotností lipidové a mRNA složky, celkových koncentrací mRNA a lipidů a rozložení mRNA nálože v závislosti na velikosti LNP.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Rychlé screeningové měření pomocí dávkového DLS (DynaPro NanoStar, 25 °C, vzorky 100× zředěné v PBS) pro hrubé posouzení velikostního složení.
• Vysokorozlišovací separace velikostních populací pomocí field-flow fractionation (Eclipse FFF, 350 µm pevný kanál) při mobilní fázi PBS.
• Online detekce: MALS (DAWN), diferenciální refraktometrie (Optilab dRI) a UV detekce při 260 nm; řízení FFF pomocí VISION; analýza dat v softwaru ASTRA s modulem LNP Analysis pro korekci UV rozptylu.
• Korekce UV rozptylu byla provedena měřením „prázdných“ LNP připravených se stejným složením lipidů podle specifikací výrobců; tyto profily sloužily ke korekci absorbance 260 nm pro přesné stanovení koncentrací mRNA.

Podstatné instrumenty a software (uvedeno explicitně):

• Eclipse FFF (fixed-height short channel 350 µm) s HPLC pumpou a autosamplerem
• DAWN MALS
• Optilab differential refractometer (dRI)
• UV detektor (260 nm)
• DynaPro NanoStar DLS
• VISION™ software pro FFF
• ASTRA™ software s LNP Analysis Module pro integraci signálů, určení molárních hmotností, dn/dc/absorpčních konstant a výpočet nálože mRNA

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání DLS a FFF-MALS:

• DLS sloužilo jako rychlý screening: dávkové DLS ukázalo, že Spikevax má obecně větší průměrnou hydrodynamickou radius než Comirnaty (poměr ~2×), avšak DLS neposkytuje dostatečné rozlišení pro detailní rozdělení subpopulací a relativních množství.
• FFF-MALS fyzikálně separoval částice podle velikosti a umožnil přesné simultánní měření velikosti, molární hmotnosti a koncentrací lipidů a mRNA.

Velikostní a molární rozdělení:

• FFF-MALS odhalilo, že oba vzorky jsou polydisperzní s rozsahy geometrických poloměrů přibližně 20–150 nm, ale Spikevax má výrazně vyšší podíl hmotnostních frakcí velkých částic: 50 % (w/w) Spikevaxu má radii >45 nm versus 12 % (w/w) u Comirnaty.
• Hmotnostní průměrné molární hmotnosti (Mw): Comirnaty 95.4 ± 2.3 MDa, Spikevax 269.8 ± 5.1 MDa — rozdíl odráží vyšší zastoupení velkých částic ve Spikevax.
• Disperzita (Đ = Mw/Mn): Comirnaty 2.58 ± 0.08, Spikevax 5.01 ± 0.11 — Spikevax je výrazně více heterogenní, což DLS cumulants nepokrývá.

Koncentrace a složení:

• Integrovaním dRI a korektované UV 260 nm signály metodu stanovila celkové koncentrace mRNA: Comirnaty 0.106 ± 0.002 mg/mL, Spikevax 0.086 ± 0.001 mg/mL, v dobré shodě se specifikacemi výrobců (~0.1 mg/mL).
• Přepočtené dávky: ~31.8 ± 0.5 µg/dávka pro Comirnaty a ~43.1 ± 0.8 µg/dávka pro Spikevax (srovnatelné se zveřejněnými hodnotami výrobců, drobné rozdíly mohou pocházet z použitých dn/dc nebo extinkčních konstant).
• Celková koncentrace lipidů stanovena na 2.06 ± 0.02 mg/mL (Comirnaty) a 1.97 ± 0.01 mg/mL (Spikevax), rovněž blízko deklarovaným hodnotám.

Velikostně závislé rozložení mRNA (payload):

• Průměrný podíl mRNA na hmotnosti částic: 4.9 ± 0.1 % (Comirnaty) a 4.2 ± 0.1 % (Spikevax), tedy v rámci očekávaných 4–5 % (w/w).
• Rozložení mRNA není konstantní napříč velikostmi: menší částice (<40 nm) u Comirnaty mají vyšší váhový podíl mRNA než odpovídající Spikevax částice; u větších částic má Spikevax vyšší mRNA podíl než Comirnaty.
• Průměrný počet mRNA molekul na LNP (odvozeno porovnáním mRNA Mw a molekulárních hmotností jednotlivých mRNA sekvencí): průměrně ~1.79 ± 0.34 mRNA/LNP pro Comirnaty a ~7.50 ± 0.66 mRNA/LNP pro Spikevax; však velmi velké částice s vysokým počtem nukleových kyselin tvoří jen malé procento počtu částic (<1 %), i když mohou nést značný podíl hmotnosti.

Diskuse významu výsledků:

• FFF-MALS poskytuje vysoké rozlišení, které odhaluje rozdíly ve velikostních a náložových profilech produktů, jež by zůstaly skryté při použití pouze dávkových metod nebo jednoduchých barvicích assay.
• Tyto informace jsou zásadní pro porozumění vazbě struktura–aktivita, optimalizaci formulace, kontrolu šarží a posuzování stability během vývoje i výroby.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednoznačná kvantifikace více atributů (velikost, koncentrace částic, molární hmotnosti lipidů a mRNA, velikostně závislé rozložení mRNA) v jediném, automatizovaném experimentu.
• Metoda nevyžaduje kalibrační křivky pro přesnou kvantifikaci a je kompatibilní s 21 CFR Part 11 (tj. vhodná pro regulované prostředí).
• Umožňuje rychlé porovnání šarží, sledování vlivu parametrů formulace a výrobního procesu, a cílené izolování nebo obohacování populací LNP s požadovanou velikostí a náloží.
• Kombinace s korekcí UV rozptylu (pomocí prázdných LNP) zvyšuje přesnost stanovení mRNA koncentrace bez potřeby separátního „lysovacího a kvantifikačního“ workflow.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření FFF-MALS analýz do rutinní kontroly kvality LNP-mRNA výrobků v regulovaných provozech včetně automatizovaných screeningů stability (mrazení/rozmrazení, skladování).
• Integrace s dalšími on-line nebo off-line technikami (např. hmotnostní spektrometrie, sekvenační analýzy volné mRNA) pro hlubší insight do integrity a konfigurace mRNA v rámci LNP.
• Vylepšení kvantitativních parametrů (přesnější dn/dc a extinkční konstanty) experimentálním určením pro konkrétní komponenty, čímž se sníží systematické odchylky v koncentracích.
• Využití dat o velikostně-závislé náloze pro cílené navrhování LNP s optimalizovanou doručovací účinností nebo redukcí nežádoucích účinků.

Závěr

Studie potvrzuje, že kombinace FFF se společnými detektory (MALS, dRI, UV) představuje robustní, automatizované a vysoce informativní platformy pro multi-atributní kvantifikaci LNP-mRNA terapeutik. Metoda odhaluje kritické rozdíly ve velikostních profilech, molárních hmotnostech, koncentracích a velikostně závislé distribuci mRNA, které standardní dávkové assay často přehlédnou. Tyto informace jsou prakticky využitelné pro vývoj, optimalizaci formulací, kontrolu šarží a rozhodování v regulovaném prostředí.

Reference

1. Hou X., et al. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nature Reviews Materials, 2021;6(12):1078–1094.
2. Corbett K.S., et al. SARS-CoV-2 mRNA vaccine design enabled by prototype pathogen preparedness. Nature, 2020;586(7830):567–571.
3. Polack F.P., et al. Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine. New England Journal of Medicine, 2020;383(27):2603–2615.
4. Podzimek S. Light scattering, size exclusion chromatography and asymmetric flow field flow fractionation: powerful tools for the characterization of polymers, proteins and nanoparticles. John Wiley & Sons, 2011.
5. Mildner R., et al. Improved multidetector asymmetrical-flow field-flow fractionation method for particle sizing and concentration measurements of lipid-based nanocarriers for RNA delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2021;163:252–265.
6. Parot J., et al. Physical characterization of liposomal drug formulations using multi-detector asymmetrical-flow field flow fractionation. Journal of Controlled Release, 2020;320:495–510.
7. World Health Organization. Messenger RNA encoding the full-length SARS-CoV-2 spike glycoprotein. Document, 2020.
8. Jeong D.-E., et al. Assemblies of putative SARS-CoV-2-spike-encoding mRNA sequences for vaccines BNT162b2 and mRNA-1273. Version 0.21 Beta, 2021.
9. Zhang X., Kenrick S. Measuring size, concentration, and zeta Potential of LNPs with the DynaPro ZetaStar. Application note.
10. Kurnik M. High-throughput freeze-thaw stability studies with the DynaPro Plate Reader. Application note.
11. COMIRNATY® Full Prescribing Information (12 years of age and older). Pfizer-BioNTech product information.
12. Fact Sheet for Healthcare Providers Administering Vaccine: Emergency Use Authorization of Moderna COVID-19 Vaccine, Bivalent (Original and Omicron BA.4/BA.5). Moderna product information.
13. Jia X., et al. Enabling online determination of the size-dependent RNA content of lipid nanoparticle-based RNA formulations. Journal of Chromatography B, 2021;1186:123015.