Carbohydrate analysis by high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAE-PAD)

Význam tématu

High-performance anion-exchange chromatography s pulsed amperometric detection (HPAE-PAD) představuje jednu z nejvýznamnějších metod pro separaci a kvantifikaci široké škály sacharidů. Díky vysokému rozlišení, citlivé detekci v řádu nízkých pikomolárních hladin a možnosti analýzy nativních (nerozštěpených) cukrů bez derivatizace se HPAE-PAD uplatnila v biochemii, potravinářství, farmacii, environmentální analytice a v biopalivech.

Cíle a přehled studie

Tento dokument aktualizuje dřívější Dionex Technical Note 20 a popisuje aktuální stav techniky HPAE-PAD. Shrnuje základy chromatografického i detekčního principu, vývoj polymerních anion-výměnných kolon rodiny CarboPac, doporučené pracovní postupy, možnosti přípravy eluční fáze včetně elektrolytické generace, postupy přípravy vzorků a přehled hlavních aplikací.

Použitá metodika a instrumentace

Princip metody spočívá v ionizaci neutrálních sacharidů při vysokém pH (>11) na oxyanionty, jejichž separace probíhá na polystyren-divinylbenzenu založených anion-výměnných kolónách s quaternárními aminy. Detekce využívá čtyřpotenciálové pulsed amperometric waveform, která střídavě oxiduje analyty, čistí a aktivuje povrch zlaté pracovní elektrody, což umožňuje detekci bez derivatizace s vynikajícím poměrem signál/šum. Eluenty připravované ručně (H2O, NaOH, NaOAc) nebo generované elektrolyticky (KOH, KMSA) zajišťují široké možnosti gradientních i izokratických separací.

Použitá instrumentace

• Chromatografický systém Thermo Scientific™ Dionex™ ICS/ICS-6000
• Anion-výměnné kolony Thermo Scientific™ Dionex™ CarboPac™ (PA1, PA10, PA20, PA200, MA1, SA10, PA300)
• Elektrochemická detekční buňka s pracovní zlatou elektrodou (disposable Au/PTFE), Ag/AgCl nebo PdH referenční elektrodou a ocelovým konterním elektrodovým tělem
• Pulsy ±0,6 V/–2,0 V dle čtyřpotenciálové vlny pro PAD
• Elektrolytické generátory eluční fáze (EGC) pro KOH a Dual EGC Mode (KOH/KMSA)

Hlavní výsledky a diskuse

Dokument mapuje evoluci CarboPac kolon od PA1 přes PA20 až po specializované kolony MA1, SA10 a PA300, optimalizované pro alkoholické cukry, sialové kyseliny, oligosacharidy a polymerní sacharidy. Ukazuje vliv pKa jednotlivých sacharidů na retenci, chemickou stabilitu vzorků při vysokém pH, a zdůrazňuje význam správné přípravy eluční fáze a údržby elektrody. Rozbor waveforms předkládá důvody pro přechod na reduktivní čištění elektrody a přednosti rychlejších datových frekvencí.

Přínosy a praktické využití metody

HPAE-PAD umožňuje:

• Komplexní monosacharidovou a sialovou analýzu glykoproteinů
• Kvalifikaci a autentizaci potravin (med, ovoce, mléčné výrobky, nápoje)
• Monitorování biologických vzorků a farmaceutik (aminoglykozidy, glukosamin)
• Kvantifikaci cukerných složek v biopalivech (dřevo, biomasa)
• Stanovení anhydrosacharidů v aerosolových vzorcích
• Profilování N- i O-vázaných glykanů a jejich přímé spojení s hmotnostní spektrometrií (HPAE-PAD/MS)

Budoucí trendy a možnosti využití

Mezi klíčové směry dalšího rozvoje patří zdokonalení elektrolytické generace elučních fází, zavádění PdH referenčních elektrod s delší životností, rozšířené využití disposable elektrod, vylepšení waveforms pro rychlé metody, automatizované postupy pro složité matice a prohloubení integrace HPAE-PAD s MS pro strukturovou charakterizaci glykanů.

Závěr

HPAE-PAD představuje stále aktuální a vysoce univerzální techniku pro analýzu sacharidů s nezanedbatelnou výhodou přímé detekce, vysoké citlivosti a minimalizace chemické úpravy vzorků. Neustálý vývoj kolon, detekčních vln a generace eluentských složek podporuje široké spektrum aplikací v řadě vědních a průmyslových oborů.

Reference

1. Lee YC. High-performance anion-exchange chromatography for carbohydrate analysis. Anal Biochem. 1990;189:151–162.
2. Townsend RR, Hardy MR. Analysis of glycoprotein using high-pH anion exchange chromatography. Glycobiology. 1991;1:139–147.
3. Lee YC. Carbohydrate analyses with high-performance anion-exchange chromatography. J Chromatogr A. 1996;720:137–149.
4. Cataldi RI, Campa C, De Benedette GE. Carbohydrate analysis by HPAE-PAD: The potential is still growing. Fresenius J Anal Chem. 2000;368:739–758.
5. Rohrer JS. Review: Analyzing sialic acids using HPAE-PAD. Anal Biochem. 2000;283:3–9.
6. Rohrer JS. HPAE-PAD for oligosaccharides in food and agricultural products. ACS Symp Ser. 2003;849:16–31.
7. Hardy MR, Rohrer JS. HPAEC with PAD for carbohydrate analysis. In: Comprehensive Glycoscience. Elsevier; 2007:303–327.
8. Behan JL, Smith KD. The analysis of glycosylation: a continued need for high pH anion exchange chromatography. Biomed Chromatogr. 2011;25:39–46.
9. Corradini C, Cavazza A, Bignardi C. HPAE-PAD as a powerful tool to evaluate food carbohydrates. Int J Carbo Chem. 2012;2012:487564.
10. Rohrer JS, Basumallick L, Hurum D. HPAE-PAD for glycoprotein carbohydrate analysis. Biochemistry (Moskow). 2013;78:697–709.
11. Paskach TJ, Lieker HP, Reilly PJ, Thielecke K. HPAE chromatography of sugars and sugar alcohols. Carb Res. 1991;215:1–14.
12. Rohrer JS, Olechno JD. Secondary isotope effect: resolution of deuterated glucoses. Anal Chem. 1992;64:914–916.
13. Rendleman JA Jr. Ionization of carbohydrates in presence of metal hydroxides. Adv Chem. 1973;51–69.
14. Lobry de Bruyn CA, van Ekenstein WA. Rec Trav Chim. 1895;14:195.
15. Anderson R, Sorenson A. Separation of alditols and sugars by HPAE-PAD. J Chromatogr A. 2000;897:195–204.
16. Olechno JD, Carter SR, Edwards WT, Gillen DG. Developments in chromatographic determination of carbohydrates. Am Biotech Lab. 1987;5:38–50.
17. Hotchkiss AT, Hicks KB. Analysis of oligogalacturonic acids by HPAE-PAD. Anal Biochem. 1990;184:200–206.
18. Rocklin RD, Clarke AP, Weitzhandler M. Improved reproducibility for pulsed amperometric detection. Anal Chem. 1998;70:1496–1501.
19. Jensen MB, Johnson DC. Anal Chem. 1997;69:1776–1781.
20. Rohrer JS. TN21: Optimal settings for pulsed amperometric detection. 2013.
21. Hurum D, Perati P, Christison T, Basumallick L, Rohrer J. TN186: Effect of working electrode gasket thickness. 2016.
22. Johnson DC. Personal communication.
23. Hurum D et al. TN110: Disposable Au/PTFE electrodes. 2011.
24. Aggrawal M, Rohrer J. TN73348: PdH reference electrode. 2020.
25. Thermo Fisher Scientific. Users’ electrochemical guide.
26. Rohrer JS. TN71: Eluent preparation for HPAE-PAD. 2017.
27. Chen Y et al. Dual electrolytic eluent generation for oligosaccharides analysis. Anal Chem. 2018;90:10910–10916.