Enhancing detection of hemoglobin variants in clinical research using dried blood spot and high-resolution accurate mass (HRAM) Orbitrap mass spectrometry

Význam tématu

Hematologické poruchy jako hemoglobinopatie a talasémie představují významnou zdravotní zátěž. Spolehlivá detekce a kvantifikace variant hemoglobinu je klíčová pro diagnostiku a monitorování nemocí jako srpkovitá anémie a další hemoglobinové dysfunkce. Metoda kombinující DBS (dried blood spots) a HRAM Orbitrap hmotnostní spektrometrie nabízí rychlý, automatizovatelný a vysoce citlivý přístup s minimální přípravou vzorku.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout top-down LC-MS workflow pro identifikaci a kvantifikaci variant hemoglobinu přímo z DBS. Využití Orbitrap Exploris 240 umožňuje vysoké rozlišení pro rozlišení blízkých hmotností variant a propojení identifikace (ProSightPD) s kvantifikací (TraceFinder) v jednom běhu.

Použitá metodika

• Příprava vzorku: 10 µL DBS vzorku, extrakce vodou, srážení acetonitrilem, příprava na 96-jamkovou destičku (<1 hodina).
• Chromatografie: Vanquish Flex UHPLC, kolona MAbPac RP 1×100 mm, 4 µm; gradient formiát/acetonitril/voda/isopropanol, průtok 0,12 mL/min, teplota 80 °C.
• Hmotnostní spektrometrie: Orbitrap Exploris 240 s BioPharma volbou; H-ESI, pozitivní ionizace, rozlišení 120 000 (m/z 200); scan range 500–3000 m/z (intaktní hmotnosti), 780–920 m/z (cílená analýza).
• Datová analýza: ProSightPD pro top-down sekvenování a identifikaci mutací; TraceFinder pro extrakci spekter a kvantifikaci pomocí nejintenzivnějších izotopových iontů z nábojových stavů +18 a +19.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Flex
• Kolona: MAbPac RP 1×100 mm, 4 µm
• MS: Thermo Scientific Orbitrap Exploris 240 s BioPharma volbou
• Software: Thermo Scientific ProSightPD, Thermo Scientific TraceFinder 5.1

Hlavní výsledky a diskuse

• Intaktní hmotnostní rozdíl mezi normální β a mutantní β (Hb S) činí 30 Da (~1,6 m/z při +19), plně separovatelný při rozlišení 120 000.
• Detekována čtyři řetězce hemoglobinu (α, β, δ, S-β) s >40% sekvenčním pokrytím β řetězců; δ řetězec potvrzuje citlivost metody i na nízkoabundantní varianty.
• Lineární kvantifikace Hb S v rozsahu 2,5–100 mg/mL, LOD 1 mg/mL, LOQ 2,5 mg/mL, koeficient lineárity R2 > 0,99.
• Mezidenní přesnost a opakovatelnost během 3 dní byla dobrá (RSD < 8 %, většina měření < 5 %).

Přínosy a praktické využití metody

• Minimalizace přípravy vzorku a vysoká propustnost (96-jamkový formát) vhodné pro masový skríning.
• Vysoké rozlišení Orbitrap MS umožňuje rozlišení izobarických variant bez komplikovaných chromatografických úprav.
• Integrovaná identifikace a kvantifikace v jediném LC-MS běhu zkracuje dobu odezvy v klinickém výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření databáze cSNP pro detekci nových a vzácných hemoglobinových variant.
• Automatizace přípravy DBS a datového zpracování pro rutinní klinickou diagnostiku.
• Aplikace metody na další proteinové biomarkery v DBS a měření post-translačních modifikací hemoglobinu.

Závěr

Top-down LC-MS s Orbitrap Exploris 240 a DBS představuje rychlý, robustní a citlivý přístup pro identifikaci a kvantifikaci hemoglobinových variant. Metoda podporuje vysoce propustné zpracování vzorků a přesné rozlišení i velmi podobných forem hemoglobinu, což zefektivňuje diagnostiku a výzkum hemoglobinopatií.

Reference

1. Bain BJ. Haemoglobinopathy Diagnosis. 2nd ed. Haemoglobin and the Genetics of Haemoglobin Synthesis. Blackwell Science; 2006.
2. Modell B, Darlison M. Global epidemiology of haemoglobin disorders and derived service indicators. Bull World Health Organ. 2008;86:480–487.
3. Billett HH. Hemoglobin and Hematocrit. In: Walker HK, Hall WD, Hurst JW, editors. Clinical Methods. 3rd ed. Boston: Butterworths; 1990. Chapter 151.