Oligonucleotide Characterization by Bio LC and Q-TOF

Význam tématu

Oligonukleotidy představují rychle se rozvíjející třídu molekul v biotechnologiích a farmacii. Jejich chemické modifikace zvyšují stabilitu, specificitu a biologickou účinnost. Spolehlivá analýza hmotnosti, čistoty, nečistot a potvrzení sekvence je nezbytná pro vývoj a kontrolu kvality nových terapeutik.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl ověřit výkonnost nové platformy Agilent 1290 Infinity II Bio LC spojené s Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF při charakterizaci dvou syntetických oligonukleotidů (18-mer ASO a 28-mer aptamer). Dva pracovní postupy v software MassHunter BioConfirm 12.0 byly testovány:

• Target Plus Impurities (TPI) pro kvantifikaci nečistot.
• Sequence Confirmation (SC) pro ověření pořadí nukleotidů.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: RNA rozlišovací standard, antisense oligonukleotid 18-mer a aptamer 28-mer se standardním desaltingem.
Instrumentace:

• Agilent 1290 Infinity II Bio LC System s biokompatibilními komponentami.
• Agilent AdvanceBio oligonukleotidová kolona, mobilní fáze s triethylaminem a hexafluoroisopropanolem.
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s Dual Agilent Jet Stream zdrojem.
• Softwarové workflow MassHunter BioConfirm 12.0 (TPI a SC).

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatografie:

• Vynikající rozlišení RNA standardu (14–21 nukleotidů) během krátkého gradientu.

Analýza nečistot (TPI):

• Detekce série 5'-zkrácených produktů ASO s vysokou přesností hmotnosti (<1 ppm).
• Reprodukovatelné relativní kvantifikace (RSD pod 5 %).

Potvrzení sekvence (SC):

• Rychlý 5minutový LC gradient umožnil získat MS/MS spektrogramy pro obě oligonukleotidy.
• 100% pokrytí sekvence pro ASO i aptamer při optimalizovaných nábojových stavech a energiích kolize.

Přínosy a praktické využití metody

Platforma nabízí robustní a rychlou kontrolu kvality syntetických oligonukleotidů v biopharmaceutickém výzkumu a výrobě. Integrace analytických dat v jednom softwaru zkracuje dobu zpracování a minimalizuje riziko chyb.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další automatizace datových workflow, rozšíření na delší a komplexnější oligonukleotidy, včetně glykosylovaných či konjugovaných variant. Vývoj regulovaných metod pro klinickou validaci a monitoring stability terapeutik.

Závěr

Použití Agilent 1290 Infinity II Bio LC a 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF poskytuje vysoce přesné chromatografické a hmotnostní výsledky. Workflow TPI a SC v MassHunter BioConfirm výrazně zefektivňuje analýzu identity, nečistot a sekvence oligonukleotidů.

Reference

• Wong D.; Rye P. An Integrated Workflow for the Analysis of Oligonucleotides and Their Impurities by Agilent High-Resolution LC/(Q-)TOF Mass Spectrometry. Agilent Technologies application note, 5994-4817EN, 2022.
• Wong D.; Rye P. A Comprehensive Workflow for Oligonucleotide Sequence Confirmation by Agilent High-Resolution LC/Q-TOF. Agilent Technologies application note, 5994-5071EN, 2022.