Scaling Reverse-Phase and Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (HILIC) Methods to HPLC

Význam tématu

Správné škálování chromatografických metod mezi UPLC a klasickými HPLC systémy je klíčové pro udržení výkonnosti analýzy, reproducibility a kvality dat v různých laboratořích a aplikacích. Tento přístup umožňuje přenášet vysoce efektivní metody vyvinuté na sub-2 µm systémech na běžné HPLC platformy, což snižuje náklady na instrumentaci a zkracuje dobu validace.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ověřit možnost škálování dvou typů metod: reverzní fáze pro analýzu feniraminu maleátu a naphazolinu HCl a HILIC metodu pro ribavirin a jeho příbuzné látky. Obě metody byly původně optimalizovány na kolónách s 1,7 µm částicemi a poté převedeny na kolóny s 2,5 a 3,5 µm částicemi a různé HPLC systémy.

Použitá metodika a instrumentace

Při škálování metod bylo klíčové zachovat poměr délky kolóny k průměru částic (L/dp) pro udržení rozlišovací schopnosti. Použita byla Gradient SmartStart technologie k vyrovnání rozdílů v objemu zpoždění (dwell volume) mezi systémy. Hlavní parametry:

• Kolóny: reverzní fáze CSH C18 a HILIC BEH Amide s částicemi 1,7; 2,5 a 3,5 µm
• Průtoky: úměrné změně velikosti částic (např. 0,3→1,2 mL/min pro RP, 0,5→2,0 mL/min pro HILIC)
• Gradientní eluce: identické složení mobilní fáze a časy přechodů, upravené o čas zahájení gradientu
• Objemy injekce: upravené dle extra-kolonní disperze (1,0–9,6 µL)

Instrumentace:

• ACQUITY UPLC H-Class Plus System
• ACQUITY Arc System
• 2998 PDA Detector
• ACQUITY PDA Detector s aktivním a pasivním předehřevem
• Alliance iS HPLC System s TUV detektorem

Hlavní výsledky a diskuse

Obě metody vykázaly na cílových HPLC systémech obdobné retenční časy, retentivní faktory (k*) a rozlišení (USP Rs) jako na UPLC. Pro reverzní fázi byly zachovány chromatografické parametry pro feniramin, naphazolin a jejich impurity na kolónách 2,5 a 3,5 µm při použití ACQUITY Arc i Alliance iS HPLC systémů. HILIC metoda pro ribavirin a příbuzné látky dosáhla srovnatelných výsledků na třech testovaných HPLC platformách. Významné bylo korigování objemu zpoždění pomocí SmartStart, což umožnilo přesné načasování gradientu.

Přínosy a praktické využití metody

Škálování UPLC metod na běžné HPLC systémy přináší následující výhody:

• Úspora investic - není nutné pořizovat sub-2 µm systémy pro každou laboratoř
• Zrychlení přenosu metod mezi laboratořemi a projekty
• Udržení vysoké kvality dat a souladu s regulačními požadavky
• Flexibilita - možnost nasazení metod na různých platformách bez nutnosti nového vývoje

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj bude směřovat k automatizovanému přizpůsobení metod pomocí softwarových nástrojů a umělé inteligence, které budou optimalizovat škálování v reálném čase. Dále se očekává širší nasazení mikro- a nanoflow LC systémů a standardizace kompenzace dwell volume napříč výrobci. Pokročilá multimodální kolona a inteligentní gradientní řízení mohou otvírat nové možnosti pro komplexní analýzy biologických vzorků.

Závěr

Studie ukázala, že reverzní fáze i HILIC metody vyvinuté na UPLC lze úspěšně přenést na běžné HPLC systémy s použitím kolón různých velikostí částic a kompenzací objemu zpoždění. Zachování poměru L/dp a inteligentní řízení gradientu zajistilo srovnatelné chromatografické výsledky a spolehlivé stanovení látek.

Reference

1. Hong H, McConville PR. Dwell Volume and Extra-Column Volume: What Are They and How Do They Impact Method Transfer? Waters White Paper, 720005723En, 2018.
2. Waters Columns Calculator. Waters Corporation, 2024.
3. Maziarz M. Scaling and Migration of a Method for Naphazoline Hydrochloride, Pheniramine Maleate and Associated Related Substances to an ACQUITY Arc System. Waters Application Note 720008189, 2024.
4. Maziarz M. Scaling and Migration of a Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (HILIC) Method for Related Compounds of Ribavirin to Modern HPLC Systems. Waters Application Note 720008255, 2024.