Aggregate analysis on Adeno-Associated Virus and Virus-Like Particle Analysis using newly developed novel Size Exclusion Chromatography Column

Význam tématu

High-resolution SEC (size exclusion chromatography) poskytuje rychlý a spolehlivý přístup k hodnocení agregace adeno-asociovaných virů (AAV) a virus-like částic (VLP), což je kritický parametr kvality pro zajištění bezpečnosti a účinnosti vektorových terapií. Metoda umožňuje oddělit monomerní částice od agregátů a tím podpořit kontrolu výroby a validaci analytických postupů.

Cíle a přehled studie

• Ověřit výkon dvou nových Agilent AdvanceBio SEC kolon určených speciálně pro AAV a VLP.
• Porovnat separaci monomer-agregát u šesti AAV sérotypů a u HPV-16 VLP při různých podmínkách průtoku a délce kolony.
• Zhodnotit reprodukovatelnost, robustnost po 1000 injekcích a porovnat se sloupci konkurenčních výrobců.

Použitá metodika a instrumentace

• LC systém: Agilent 1290 Infinity II Bio LC s binárním vysokorychlostním čerpadlem a 1260 Infinity II fluorescence detektorem (λex=280 nm, λem=348 nm).
• Kolony: AdvanceBio SEC 500 Å a 1000 Å, částice 2,7 µm, rozměry 4,6×300 mm a 4,6×150 mm.
• Mobilní fáze: 50 mM fosfátový pufr, 400 mM NaCl, pH 7,2, průtok 0,15–0,35 mL/min.
• Vzorky: AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9 (referenční kapsoidy) a HPV-16 VLP (1 mg/mL).

Hlavní výsledky a diskuse

• Fast separation: Na 4,6×150 mm SEC 500 Å sloupci dosaženo baseline separace AAV9 pod 6 min při různých průtocích (Rs 2,23–2,94).
• Šest sérotypů AAV: Výborné rozlišení monomeru a agregátu pro každý sérotyp s agregací 0,9–4,1 % a monomerem 95,9–99,1 %.
• Reprodukovatelnost: Injekce-injekce i výroba-výroba (batch-to-batch) měla RSD ≤1 % pro retenční časy, rozlišení i oblast píků.
• Robustnost: Po 1000 injekcích AAV9 zůstala rozlišitelnost monomer-agregát konzistentní, změna RT <0,1 min a rozlišení stabilní kolem Rs 3,3.
• Forced degradation: Termické stresování HPV-16 VLP ukázalo postupné zvyšování agregace při 45 °C, přičemž byla zachována jasná separace.
• Porovnání s konkurencí: AdvanceBio SEC sloupce poskytly vyšší rozlišení a návratnost oproti kolonkám jiných výrobců.

Přínosy a praktické využití metody

Rychlá analýza (<6 min), robustní baseline separace, vynikající reprodukovatelnost a možnost vysokopropustného režimu jsou ideální pro rutinní QC analytiku AAV a VLP ve výrobě genové a buněčné terapie.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace SEC s detekcí pomocí multi-angle light scattering a ESI-MS pro přesnější stanovení molekulové hmotnosti a složení částic.
• Optimalizace pore size sloupců pro další třídy virových vektorů a lipidních nanočástic (LNP).
• Automatizace a validace metodiky pro širší implementaci v GMP prostředí.

Závěr

AdvanceBio SEC kolony splňují náročné požadavky na analýzu agregace AAV a VLP, nabízejí vysokou rychlost, spolehlivost a stabilitu. Jejich použití v QC laboratořích podporuje efektivní kontrolu kvality genových terapií.

Reference

Bez uvedených literárních zdrojů