Robust Wide Pore Size Exclusion Columns for Virus-Like Particles (VLPs) Analysis

Význam tématu

Virus-like particles (VLP) představují bezpečné nanostruktury (20–150 nm) bez virového genetického materiálu, široce využívané v oblasti vakcín a bioterapeutik. Agregace VLP je klíčová kritická kvalita, jejíž kontrola je nezbytná pro zajištění stability a účinnosti finálního produktu.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo ověřit schopnost nové Agilent AdvanceBio SEC kolony s širokými póry (1000 Å, 2,7 µm) spolehlivě separovat monomerní VLP od jejich dimerů a vyšších agregátů. Modelovým analytem byl rekombinantní HPV-16 L1 protein VLP (průměr 50 nm).

Použitá metodika a instrumentace

• Kolona: Agilent AdvanceBio SEC 1000 Å, 2,7 µm, 4,6 × 300 mm
• Mobilní fáze: 50 mM fosfátový buffer + 400 mM NaCl, pH 7,2, filtrováno 0,2 µm filtrem
• Průtok: 0,35 mL/min, injekční objem 1 µL, doba běhu 15 min, pokojová teplota
• Detektory: UV (220/280 nm) a fluorescenční (exc. 280 nm, em. 348 nm) na Agilent 1290 Infinity II Bio LC (DAD) a Agilent 1260 Infinity II FLD
• Software: Agilent OpenLab CDS ChemStation
• QC standard: Agilent AdvanceBio SEC 300 Å s monomerním bovinním thyroglobulinem (670 kDa)

Hlavní výsledky a diskuse

• Detekce: 220 nm poskytla vyšší signál než 280 nm; fluorescenční detektor v sérii s UV zlepšil citlivost bez ztráty rozlišení.
• Separace: Monomer a dimer HPV-16 VLP baseline separovány s rozlišením ~1,67, vyšší agregáty rovněž identifikovány.
• Reprodukovatelnost: Injekce (n=5) vykázaly RSD 0 % pro retenci a < 2 % pro plošný obsah; čtyři šarže kolony ukázaly RSD < 1 % až 10 % pro klíčové parametry.
• Porovnání s Bio SEC-5 (5 µm): AdvanceBio SEC s menšími částicemi a vyšším pórovým objemem nabídla užší špičky a lepší separaci včetně vysokomolekulárních agregátů.

Přínosy a praktické využití metody

• Spolehlivá kontrola agregace VLP v procesu vývoje a výroby bioterapeutik.
• Vysoká citlivost a rozlišení monomerů, dimerů i vyšších agregátů.
• Robustní a reprodukovatelná metoda vhodná pro rutinní QA/QC laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace SEC-HPLC s orthogonálními technikami (DLS, AUC) pro komplexní profilování částic.
• Rozšíření aplikace na jiné nanoformulace, nosiče vakcín a makromolekulární biologické látky.
• Další vývoj detekčních systémů pro analýzu nízkokoncentrovaných a vzácných agregátů.

Závěr

Agilent AdvanceBio SEC 1000 Å kolona prokázala vynikající rozlišení, citlivost a reprodukovatelnost při analýze VLP agregátů. Metoda je vhodná pro rutinní kvalitu a vývoj bioterapeutik, zejména u velkých nanočástic.

Reference

1. Schneider S. Determination of Protein Molecular Weight and Size Using the Agilent 1260 Infinity Multi-Detector Bio-SEC Solution with Advanced Light Scattering Detection. Agilent Technologies Application Note, publikace 5991-3955EN, 2014.